[發明專利]一種氯代烴高效好氧降解混合菌劑的制備方法與應用

無效

• 申請號: 201210049034.0
• 申請日: 2012-02-29
• 公開（公告）號: CN102533619A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 李輝;林匡飛;劉勇弟;沈婷婷;呂樹光;陸強
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;B09C1/10;C02F3/34;C12R1/01;C02F101/36
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218
• 代理人: 翟羽;施春花

1.一種氯代烴好氧降解混合菌劑的制備方法，包括馴化、分離和鑒定，其特征在于，包括以下步驟：

（1）?取999.0mL基礎培養基、1.0mL微量元素，搖勻后作為液體無機鹽培養基備用；取50mL所述液體無機鹽培養基，在溫度為121℃的高壓鍋內滅菌20分鐘，在超凈臺中冷卻，再加入2?g受TCE污染的土壤，30?℃，轉速180?r/min條件下，避光、恒溫振蕩，培養36?h，獲得培養菌液；?

（2）?取步驟（1）中獲得的培養菌液5?mL,?轉接到裝有10?mg/L?TCE和0.15?g/L葡萄糖的上述新鮮液體無機鹽培養基中，馴化培養直至溶液渾濁得到馴化培養基；?

（3）?配置分離培養基，調pH至7.0，用去離子水定容至1000?mL，121?℃高壓蒸汽滅菌后，在超凈臺中冷卻至38~40℃，在超凈工作臺中取步驟（2）獲得的馴化培養基1?mL，按10倍稀釋法將菌液稀釋成10^-1-10^-7梯度的菌懸液，取0.1?mL涂布于上述分離培養基上，用無菌涂布器涂布均勻，將培養皿置于30?℃的生化培養箱中培養觀察，48h后便可發現有明顯菌落出現，挑選菌落，將其接種至上述分離培養基中，在溫度30℃、轉速180?r/min的振蕩器中培養48?h得到菌液；

（4）以所得菌液作為接種物，添加到含有TCE?50?mg/L的基礎培養基中，菌液和基礎培養基的體積比為1:10，培養溫度為30?℃，培養時間為36~48?h，經離心得到菌液，按體積比500：1加入酵母提取物和麥麩的保護劑，然后利用真空冷凍干燥機制備成固體氯代烴好氧降解混合菌劑。

2.根據權利要求1所述的一種氯代烴好氧降解混合菌劑的制備方法，其特征在于，在步驟（3）之后、步驟（4）之前還包括步驟（3A），所述步驟（3A）為：將步驟（2）至步驟（3）作為一個分離純化周期，重復步驟（2）至步驟（3），但每次用前一個分離純化周期中步驟（3）獲得的菌液代替步驟（2）中初始用到的培養菌液，分離純化6個周期以上得到菌液。

3.根據權利要求1所述的一種氯代烴好氧降解混合菌劑的制備方法，其特征在于，步驟（1）中所述基礎培養基的組成為：Na₂HPO_4?：4.26g.L^-1，KH₂PO_4?：2.65?g.L^-1，NH₄Cl：0.5?g.L^-1，FeCl₂·4H₂O?：0.01?g.L^-1，CaCl_2?：0.02?g.L^-1，MgSO₄·7H₂O?：0.2?g.L^-1；所述微量元素的組成為：HBO₃：0.3?g.L^-1，ZnCl₂：0.07g.L^-1，NaMoO₄·2H₂O：0.024g.L^-1，MnCl₂·4H₂O：0.006g.L^-1，NiCl₂·6H₂O：0.75?g.L^-1，CoCl₂·6H₂O：0.19?g.L^-1。

4.根據權利要求1所述的一種氯代烴好氧降解混合菌劑的制備方法，其特征在于，步驟（2）的馴化培養，一般以3?d作為一個馴化周期，一個馴化周期后，取5?mL馴化后的菌液轉接至設定TCE濃度的新鮮液體培養液中，馴化過程中的TCE的濃度為10?mg/L、20?mg/L、30?mg/L、50?mg/L、75?mg/L、100?mg/L。

5.根據權利要求1所述的一種氯代烴好氧降解混合菌劑的制備方法，其特征在于，步驟（3）中分離培養基的配制方法為，NaCl?5g,，牛肉膏5?g，胰蛋白胨10?g，用5?mol/LNaOH調pH至7.0，用去離子水定容至1000mL，121?℃高壓蒸汽滅菌后，在超凈臺中冷卻至38—40℃獲得。