[發明專利]阻斷HIV-1膜融合的小環型DNA重組載體及其應用

有效

• 申請號: 201210048534.2
• 申請日: 2012-02-28
• 公開（公告）號: CN103290049A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 田波;潘煦文;孟頌東
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/85;A61K48/00;A61P31/18
• 代理公司: 北京市漢信律師事務所 11373
• 代理人: 王文生

技術領域

本發明屬于病毒學領域，具體涉及一種能真核外分泌表達HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小環型DNA重組載體，其包含編碼HR212的核苷酸序列和小環DNA載體。本發明還涉及一組阻斷HIV-1膜融合過程的小環型DNA基因治療劑，其包含能真核外分泌表達HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小環型DNA重組載體，其有效成分是編碼七肽重復三螺旋蛋白HR212的核苷酸。本發明還涉及編碼七肽重復三螺旋蛋白HR212的小環型DNA重組載體在制備用于抗HIV-1的感染的基因治療劑中的應用。

背景技術

HIV感染已經是全球性的公共安全問題，過去兩次有代表性的疫苗臨床試驗的失利顯示了HIV疫苗開發的難度、短期內疫苗上市期望的渺茫。因而開發新的HIV抑制劑也將是長期的任務。現有的HIV小分子抑制劑是控制HIV感染后患者疾病發展的主要手段，但是這些藥物的副作用以及HIV病毒的高變異能力，是激發尋求現有藥物基礎以外的其它治療藥物的源動力。尋求非傳統形式的預防HIV特定途徑感染的藥物，是目前發展的一個重要方向，特別是隨著感染人數的增加，生活觀念的改變，出現易感人群開始向普通大眾轉移的趨勢。尋找更多其它類型的治療性藥物，仍有重要的意義。

1.HIV藥物的耐藥性以及膜融合抑制劑的優點：

目前，HIV治療的主流藥物是逆轉錄酶抑制劑與蛋白酶抑制劑，近年來Merck開發的整合酶抑制劑也是有效的小分子抑制劑，還有許多其它正在研究的HIV病毒釋放、包裝相關的抑制劑等。

但是，艾滋病病毒是一種突變率極高的病毒，美國疾病控制和預防中心，對美國10個城市700多例尚未治愈病人的抗逆轉錄病毒藥耐藥情況調查后發現，抗艾滋病病毒藥耐藥發生率因危險程度、種族、地區和檢查時間差異而不同。因此，艾滋病病毒的流行并非單一不變，而是呈多樣化、重疊式地方性流行。這些都將增加單一藥物治療艾滋病的困難，

由于艾滋病病毒的多變與頑固，臨床上提倡多種藥物配伍使用治療。使用兩種不同的核苷類逆轉錄酶抑制劑(如齊多夫定、拉米夫定、斯它夫定、扎西它賓、雙脫氧肌苷等等)，加上一種(或兩種)蛋白酶抑制劑(如英迪那菲、里托那菲等等)的雞尾酒療法是常用的策略。但是其仍不能解決小分子藥物本身靶位點局限性，微小的突變就可能使藥物失效，而產生新的耐藥株。

目前，研究發現HIV病毒感染宿主細胞時，需要通過一個膜融合的過程。在該過程中，HIV病毒參與這一膜融合過程的囊膜上的gp41分子中有相對保守的兩段區域，可作為構建病毒抑制劑的元件。

由于該類抑制劑具有廣泛的抑制活性及高抗變異HIV株的特性，使得該類產品的潛在需求巨大，如防止母嬰傳播、機會感染等預防型用藥，以及對于現有藥物產生耐藥性時的替代用藥等，市場需要明確。

本發明中用到的HR212，是我們找到的一種有效的七肽重復三螺旋HIV抑制劑的組合方式(Ni，L.，G.F.Gao，et?al.2005)。通過真假病毒實驗，嚴格地按《抗HIV藥物非臨床藥效學研究技術指導原則》(國食藥監注[2006]639號)的要求檢測的結果，可以確認它在納摩爾濃度抑制HIV復制，其抗HIV活性與FDA批準上市的多肽融合抑制劑T-20相似；它同時也在納摩爾濃度抑制T-20耐藥株復制；而且該蛋白穩定性高，其藥效時間比T-20要長10倍以上。對酸、蛋白酶、溫度有較強的耐受力(Pang，W.，R.R.Wang，et?al.2008)。因而外分泌表達該蛋白更具潛力。

2.小環型DNA制劑的優勢

使用小環DNA作為基因治療的載體，由于它去除了復制子、抗性基因以及其它一些易于產生免疫原性區和易于產生基因沉默的序列，有較高的安全性且易于表達。同時，小環DNA由于去除非必需基因后，序列長度變短，更有利于將基因轉染進細胞。另外，小鼠體內實驗證實，體內基因給藥時，小環DNA作用存活的時間長達三周，比一般質粒多一周。這幾個方面共同決定了小環DNA具有其它載體不可替代的優勢。

3.本發明的重要特點

使用小環型載體表達特定基因，是一項容易獲知的技術。但是使用已知的技術，將能表達HR212的基因克隆到小環載體上，表達HR212蛋白是可以實現的，但要將HR212蛋白分泌到細胞外，相當艱難。目前為止，還沒有人能夠實現將HR212蛋白分泌到真核細胞外的表達。