[發明專利]抗痘苗病毒IgY抗體的制備

無效

• 申請號: 201210047813.7
• 申請日: 2012-02-16
• 公開（公告）號: CN102827273A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 張小鶯;韓水仲
• 申請（專利權）人: 張小鶯;韓水仲
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;C07K16/02;C07K1/30;G01N33/569
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技術領域

本發明屬于生物技術領域中的一種特異性卵黃抗體(egg?yolk?antibody，IgY)的制備和應用，特別涉及抗痘苗病毒IgY抗體的制備方法及其該抗體用于痘苗病毒免疫診斷試劑的用途。?

背景技術

痘苗病毒(Vaccinia?Virus，VACA)屬于正痘病毒屬(Orthopoxvirus)成員，可以作為疫苗預防天花，同時可以作為實驗用痘病毒的模型。痘苗病毒自然狀態下可在家畜和實驗動物中傳播，引起牛的乳頭感染以及免疫。痘苗病毒也可造成人的感染，尤其對危險人群(如孕婦、免疫缺陷者、皮膚病患者)感染可導致嚴重的并發癥。人接種痘苗病毒疫苗后可獲得對天花病毒的免疫力，但隨著天花病在全球的滅絕，痘病毒疫苗已在很多國家和人群中放棄使用。由于人畜密切接觸等多種原因，目前在人和相關動物物種中，正痘病毒的感染與發病呈明顯上升趨勢，獲得有關痘病毒的抗體及其檢測試劑對于在人類醫學與獸醫中該病原體的診斷與中和性治療具有重要意義。?

IgY抗體是通過對禽類(雞)免疫注射特定抗原，從而在體內產生IgY，經血液由母體傳遞到卵黃內，在卵黃中富集，進而通過分離卵黃，獲得的特異性多克隆抗體。相對于從哺乳動物血清中獲得抗體，避免了常規的動物采血，減輕了動物的痛苦，同時通過卵黃獲得抗體，產量大，制備簡單，每枚蛋中可以提純50～100mg的抗體，且母雞易于飼養，費用低，便于大規模的生產特異性抗體，經濟優勢明顯。與哺乳動物IgG相似，IgY的Fab片段包含抗原結合位點，Fc片段包含的位點有補體激活功能、調理素作用和致敏過敏反應作用等功能。但是其結構同哺乳動物有些不同，相對于IgG，IgY重鏈的氨基酸殘基數量多于IgG，?且重鏈恒定區(CH區)數量多于IgG，而輕鏈小于IgG。IgY理化特性及抗酶解特性等不同于IgG，使IgY相對于IgG更適合用于治療制劑。IgY等電點(PI)在5.7-7.6之間，在pH4.0～11.0時IgY穩定，比兔IgG對酸變性更為敏感，當pH值從4降到3時，IgY活性迅速喪失，而IgG對此只受到微小影響；IgY在低溫下儲存時性能較穩定，室溫下可保持6個月的活性，4℃儲存6～7年活性下降僅5％(Jaradat?ZW，Marquardt?R?R.2000.Studies?on?the?stability?of?chicken?IgY?in?different?sugars，complex?carbohydrates?and?food?materials.Food?andAgricultural?Immunology，12(4)：263-272)；IgY抗胃蛋白酶消化的穩定性較牛IgG差，但抗胰蛋白酶和糜蛋白酶能力則較強(Shimizu?M，Nagashima?H，Sano?K，et?al.1992.Molecular?stability?of?chicken?and?rabbit?immunoglobulin?G.?Biosci?Biotechnol?Biochem，56(2)：270-274)。由于系統發生學距離造成哺乳動物和雞抗體特異性的差異，相對于哺乳動物IgG，卵黃抗體應用于檢測也具有多方面的優勢如：卵黃抗體與風濕因子、人類抗鼠抗體(HAMA)沒有交叉反應，無補體系統活性和異質性凝集素，且不結合蛋白A和蛋白G，可以避免交叉反應。此外，禽類針對保守性強的蛋白質往往能引發較哺乳動物抗體更強烈的抗體反應，成為有關抗體研發的重要選擇因素。?

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種抗VACA卵黃抗體的制備方法。?

本發明的第二個目的是提供制備的抗VACA-IgY對VACA感染的體外中和作用。?

本發明的第三個目的是提供將制備的抗VACA-IgY抗體偶聯免疫磁珠的方法，以便對含VACA的檢測物進行富集，用于檢測VACA。?

為了實現上述任務，本發明采取如下的技術方案：?

1抗VACA卵黃抗體的制備方法?

(1)抗原制備?

a：VACA多次接種齡雞胚胎成纖維細胞(CEF)，孵育后，超速離心，懸于PBS緩沖液；?

b：福爾馬林滅活VACA，貯存-70℃備用。?

(2)免疫方法?

初次免疫用費氏完全佐劑乳化的抗原肌肉注射免疫16周齡白色來航雞，免疫劑量400μg；初免后36天二免，使用費氏不完全佐劑，免疫劑量400μg；72天后三免，免疫劑量2000μg；148天四免，免疫劑量1000μg；319天五免，免疫劑量2000μg；389天六免，免疫劑量2000μg。每日收集雞蛋，做標記，4℃保存。?