[發明專利]基于LAMP的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法

無效

• 申請號: 201210047714.9
• 申請日: 2012-02-28
• 公開（公告）號: CN102586438A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 王業富;盧暄;鄭虎
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 黃瑞棠

技術領域

本發明涉及一種微生物基因檢測方法，尤其涉及一種基于LAMP的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法，適用于微生物定性檢測。

背景技術

微生物是包括細菌、病毒、真菌以及一些小型的原生動物和顯微藻類等在內的一大類生物群體。微生物個體微小，卻與人類生活關系密切，涵蓋了有益有害的眾多種類，廣泛涉及健康、食品、醫藥、工農業和環保等諸多領域。微生物對人類最重要的影響之一是導致傳染病的流行，在人類疾病中有50％是由病毒引起。食品污染嚴重威脅人類身體健康，食源性致病菌是引起細菌性食物中毒的病原體。因此，微生物檢測在人類社會生活中具有極其重要的意義，開發一種快速靈敏的微生物基因檢測方法十分必要。

傳統檢測微生物的培養方法，需要分離、篩選和生化鑒定，必要時還需要血清學鑒定，一般為4～6d，費時費力，具有靈敏度低、特異性差、假陽性和耗時費力等缺點。

各種常規PCR(Polymerase?Chain?Reaction聚合酶鏈式反應)方法具有敏感性強、特異性高、簡便和快速等優點，有較多應用于微生物基因檢測的報道，但由于存在PCR后處理產生污染導致的假陽性等問題以及需要特殊的儀器設備而限制了其在基層單位的應用。

近年來發展起來的LAMP(loop-mediated?isothermal?amplification，環介導等溫擴增技術)以其靈敏度高、速度快和特異性強等優點在基因定性檢測方面得到廣泛應用，并且已經成為當前核酸定性檢測的重要方法之一。

LAMP是一種新型的等溫核酸擴增方法，該方法針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst?DNA聚合酶)，在恒溫條件(65℃左右)保溫約60min，即可完成核酸擴增反應，產生肉眼可見的反應副產物——白色焦磷酸鎂沉淀。該方法具有不需要PCR儀、肉眼可判斷結果及反應時間短、特異性強和靈敏度高等優點。

因此焏待開發一種精確、靈敏、快速和無污染的臨床檢驗方法。

發明內容

本發明的目的就在于克服現有技術存在的缺點和不足，并針對LAMP出現的白色焦磷酸鎂沉淀肉眼難以辨別問題做出改進，提供一種基于LAMP的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法(簡稱檢測方法)。

本發明的目的是這樣實現的：

基本思路：

本檢測方法先按照國標法用緩沖蛋白胨水增菌培養待檢樣品，然后利用水煮法提取樣品DNA，接著將提取到的樣品DNA進行恒溫擴增，最后通過熒光顯色法用肉眼直接判斷檢測結果。

具體地說，本檢測方法包括下列步驟：

①用緩沖蛋白胨水(Buffer?Peptone?Water簡稱BPW)按照國標法培養待檢樣品4h；

②用水煮法從待測樣品中提取DNA；

③將DNA加入到LAMP反應體系中，65℃保溫1h；

④通過與對照組比較，肉眼觀察待測樣品結果，對樣品進行定性分析；

所述LAMP反應體系包括LAMP反應液和熒光顯色劑；

a)LAMP反應液

LAMP反應液由LAMP?10×buffer?2.5μl，20μmol/L內引物FIP、BIP各2.0μl，20μmol/L外引物F3、B3各1.0μl，25mmol/L?dNTPs?3.0μl，50mmol/L?MgSO₄3.0μl，1.0mol/L甜菜堿5μl，Bst?DNA聚合酶大片段1.0μl，無菌雙蒸水2.0μl組成，反應液總體積22.5μl；

b)熒光顯色劑

熒光顯色劑是由10μmol/L-20mmol/L的鈣黃綠素1μl和60μmol/L-0.1mol/LMnCl₂?0.5μl組成。

本發明的工作原理：

在本發明提供的LAMP反應體系中含有熒光顯色劑(鈣黃綠素和MnCl₂)，在等溫擴增反應之初，鈣黃綠素與熒光淬滅劑MnCl₂結合而不發熒光。由于反應生成的焦磷酸根離子更容易與錳離子結合從而釋放了鈣黃綠素，游離的鈣黃綠素就可以自發熒光，在鎂離子存在的條件下，這種熒光效果得到了加強。因此，當使用本發明檢測樣品時，在恒溫條件(65℃左右)保溫約1h后，在日光燈下陽性樣本管呈綠色，陰性樣本管呈橙色，在紫外燈下，陽性樣本管顯示強熒光，陰性樣本管則不顯示熒光。