[發(fā)明專利]一種EBV病毒豚鼠動物模型的建立方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210047649.X
• 申請日: 2012-02-28
• 公開（公告）號: CN102812924A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉國超;胡云章;胡凝珠;王海漩
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 徐玲菊

1.一種EBV病毒豚鼠動物模型的建立方法，其特征在于經(jīng)過下列步驟：

A、將0.1ml病毒滴度為1.0×10⁶~1.0×10⁷的EBV病毒液經(jīng)豚鼠鼻腔滴鼻，進行EBV病毒接種；

B、接種后1周，取5ml豚鼠血液與5ml?RPMI?1640培養(yǎng)基混勻，加于10ml豚鼠淋巴細胞分離液之上，2000r/min離心20min，使細胞分為四層；

C、收集第二層細胞并放入5ml含RPMI?1640培養(yǎng)基中，混勻，1500r/min離心20min，分離出的沉淀用RPMI?1640培養(yǎng)基反復(fù)重懸洗2次后收集；

D、在步驟C收集的淋巴細胞上加入1ml?TRIZOL，常溫靜置1h，加入0.2ml氯仿，混合至乳白色無分相，室溫靜置5min，4℃?13500r/min離心15min，取上層液并加入等體積異丙醇，混勻，靜置10min，4℃?13500r/min離心10min，去上清，向沉淀物中加入1ml?-20℃預(yù)冷的質(zhì)量濃度為75%的乙醇，清洗，4℃，13500r/min離心5min，去上清，室溫放置干燥后用RNase?free?dH₂O溶解，得到總RNA；

E、采用20μL反應(yīng)體系對步驟D得到的總RNA進行RT逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；

F、以cDNA為模板用Nested-PCR擴增，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外觀察并攝片；

G、回收步驟F的目的DNA片段，經(jīng)純化后，將目的DNA片段連接在pGEM-T載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定后，測序，建立起EBV病毒豚鼠動物模型。

2.如權(quán)利要求1所述的EBV病毒豚鼠動物模型的建立方法，其特征在于所述步驟E的反應(yīng)體系包括：MgCl₂,4μl；Reverse?Transcription?10X?Buffer，2μl；dNTP?Mixture，2μl；Recombinant?RNasin??Ribonuclease?Inhibitor，0.5μl；AMV?Reverse?Transcriptase，15u；Oligo(dT)₁₅?Primer，0.5μg；total?RNA?，1μg；Nuclease-Free?Water補至20μl；反應(yīng)條件為：42°C?15?minutes,?95°C?5?minutes,，4°C?5?minutes；使用β-Actin基因做內(nèi)參用于評價提取的RNA質(zhì)量。

3.如權(quán)利要求1所述的EBV病毒豚鼠動物模型的建立方法，其特征在于所述步驟F的Nested-PCR擴增為：取2μL?cDNA加入到48μL?PCR反應(yīng)體系中，EBNA1第一輪PCR程序：?94℃預(yù)變性2min，94℃熱變性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)，72℃延伸5min；第二輪PCR程序：94℃預(yù)變性2min，94℃熱變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)，72℃延伸5min；BcLF1第一輪PCR程序：94℃預(yù)變性2min，94℃熱變性1min，64℃退火1min，72℃延伸2min，40個循環(huán)，72℃延伸5min；第二輪PCR程序：94℃預(yù)變性1min，94℃熱變性1min，57℃退火1min，72℃延伸1.5min，35個循環(huán)，72℃延伸5min，經(jīng)Nested-PCR擴增后產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外觀察并攝片。

4.如權(quán)利要求1所述的EBV病毒豚鼠動物模型的建立方法，其特征在于所述步驟F的Nested-PCR擴增中的引物核酸序列為：

目的基因為EBNA1的引物序列：

F1：5’-TCTGGAGCCTGACCTGTGAT-3’，

R1：5’-CTCCTCGTCCTCGTCCTCTT-3’；

F2：5’-ATAGACCGCCAGTAGACCTG-3’，

R2：5’-GGTTATCACCCCCTCTTCTT-3’；?

目的基因為BcLF1的引物序列：

F1：5’-TATGCCCAATCCCAAGTACACG-3’，

R1：5’-TGGACGGGTGGAGGAAGTCTTC-3’?

F2：5’-ACACAGCAGCTACCGGTGGA-3’，?

R2：5’-TGTTGCAGGGAGTAGGTCTC-3’

目的基因為β-Actin的引物序列：

F：5’-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3’?

R：5’-GCTAGAAGCATTTGCGGTGCTCGATGGAGG-3’。