[發明專利]抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201210047016.9
• 申請日: 2012-02-27
• 公開（公告）號: CN102608313A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 董小平;韓俊;陳操;高晨
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所
• 主分類號: G01N33/576
• 分類號: G01N33/576
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及甲肝病毒的免疫學檢測，具體地說，涉及抗甲型肝炎病毒IgM?AlphaLISA檢測試劑盒。?

背景技術

甲型肝炎病毒(HAV)是感染人類甲型肝炎的主要病原。主要是經糞口傳播途徑感染，即由病人的潛伏期或急性期糞便、血液中的甲肝病毒污染水源、食物、用具及生活密切接觸經口進入胃腸道而傳播。兒童和青少年人群多發。HAV感染的診斷依據是檢出HAV的抗體。當前，抗-HAV?IgM是早期診斷甲型肝炎的特異性較高的指標，且有簡便，快速的優點。抗-HAV?IgM在發病后1周左右即可在血清中測出。因此，可以通過檢測抗-HAV?IgM來建立診斷甲型肝炎的診斷方法。?

發明內容

本發明的目的是提供一種抗甲型肝炎病毒IgM?AlphaLISA檢測試劑盒。?

為了實現本發明目的，本發明的一種抗甲型肝炎病毒IgM?AlphaLISA檢測試劑盒，其包括供體微珠、受體微珠及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原，其中，所述供體微珠包被有含25mM?HEPES、100mM?NaCl和0.05％?Proclin-300，pH7.2的鏈霉親和素溶液；所述受體微珠包被有含0.05％?Proclin-300，pH7.2的Anti-IgM的PBS溶液。?

前述的試劑盒，包括供體微珠20μg/ml、受體微珠5μg/ml以及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原6×10^-8ng/孔；使用時，以總體系10μl計，每孔添加量為：受體微珠4μl、供體微珠5μl、生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原6×10^-8ng及血清1μl。?

前述抗甲型肝炎病毒IgM?AlphaLISA檢測試劑盒的制備方法，其?是將含25mM?HEPES、100mM?NaCl和0.05％?Proclin-300，pH7.2的鏈霉親和素溶液包被至供體微珠上；將含0.05％?Proclin-300，pH7.2的Anti-IgM的PBS溶液包被至受體微珠上；生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原的制備過程為：用甲肝病毒TZ84株感染人胚肺二倍體細胞2BS株，培養細胞至病毒增殖高峰期，14天后收獲細胞懸液，經氯仿抽提、PEG沉淀、離心后，用β-丙內酯滅活，濃縮后即得甲肝病毒TZ84株抗原，最后對得到的甲肝病毒TZ84株抗原進行生物素化。?

具體地，生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原的制備方法包括以下步驟：?

(1)將甲肝病毒TZ84株接種到人胚肺二倍體細胞2BS株中，培養至病毒增殖高峰期；?

(2)14天后收獲的感染細胞懸液經凍融、超聲各3次釋放病毒；?

(3)進行氯仿抽提，10％聚乙二醇濃縮，8000r/min，4℃離心1h；?

(4)用含2％SDS的Tris-NaCl緩沖液懸浮沉淀，經蔗糖/甘油不連續密度梯度離心，從底層收獲甲肝病毒抗原；其中，蔗糖/甘油不連續密度梯度為0.5ml?80％甘油，1.8ml?30％蔗糖，1.8ml?20％蔗糖，1.8ml10％蔗糖，1％SDS；離心條件為18℃，37000r/min，6h；?

(5)用β-丙內酯滅活甲肝病毒抗原后，進行超速離心濃縮；?

(6)對步驟(5)中得到的甲肝病毒抗原進行生物素化，具體為：?

(i)加入100μlWS緩沖液和60μl約123μg的濃縮甲肝病毒抗原到超濾管中；?

(ii)離心1000g，10min；?

(iii)將10μl二甲基亞砜加入到裝有NH₂-reactive?biotin的管中，用移液器吹打混勻；?

(iv)加入100μl反應緩沖液和8μl?NH₂-reactive?biotin到超濾管中，用移液器吹打混勻，37℃孵育30min；?

(v)加100μl?WS緩沖液到超濾管中，離心10000g，10min，棄?濾液；?

(vi)加200μl?WS緩沖液到超濾管中，離心10000g，10min，重復此步驟一次；?

(vii)加入200μl?WS緩沖液，用槍頭吹打10至15次，重懸此結合物；?

(viii)分裝于200μl?PCR中，加等量甘油，-20℃保存。?

借由上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果：?