[發(fā)明專利]耐輻射異常球菌R1 ytxH基因培育耐鹽植物的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210046539.1
• 申請日: 2012-02-24
• 公開（公告）號(hào): CN102586283A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林敏;江世杰;張維;王勁;趙鵬;陳明
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/15;C12N1/19;C12N5/10;A01H5/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及耐輻射異常球菌R1(Deinococcus?radiodurans?R1)ytxH基因(DR0105GeneID：1799501)的新功能，具體涉及該基因在改良植物對鹽脅迫抗性方面的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

土壤鹽漬化是一個(gè)世界性的資源問題和生態(tài)問題，越來越引起人們的重視。隨著分子生物學(xué)的技術(shù)進(jìn)步，使基因的定位、分離、轉(zhuǎn)移成為現(xiàn)實(shí)，在提高農(nóng)作物耐鹽能力方面起著重要的作用。?

耐輻射異常球菌R1(D.radiodurans?R1)因具有對電離輻射、UV輻射、DNA損傷試劑及滲透脅迫等極強(qiáng)抗性，而成為研究微生物非生物脅迫適應(yīng)機(jī)制的理想菌株，也可作為一個(gè)研究高等植物耐鹽的模式物種(Battista?et?al.，2001)。來源于D.radiodurans?R1基因組中一個(gè)大質(zhì)粒，其編碼的蛋白與滲透脅迫抗性相關(guān)。ytxH基因(DR0105)編碼的蛋白YtxH(含有40-50aa的保守區(qū)段)屬于Lea76家族，與滲透脅迫相關(guān)。?

但目前未見耐輻射異球菌Deinococcus?radiodurans?R1中的ytxH基因(DR0105GeneID：1799501)在提高植物耐鹽性方面的功能的研究報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是從D.radiodurans?R1基因組中發(fā)現(xiàn)能夠提高植物對鹽抗性的基因。并將該基因轉(zhuǎn)入植物，使轉(zhuǎn)入該基因的植物獲得耐鹽的性狀。?

本發(fā)明通過如下研究發(fā)現(xiàn)，Deinococcus?radiodurans?R1的ytxH基因(DR0105GeneID：1799501)具有耐高滲和鹽脅迫的功能，可用于培育耐鹽性狀的植物：?

1、獲得含有D.radiodurans?R1ytxH基因(DR0105)的重組工程菌株?

1)通過PCR從D.radiodurans?R1(DSM?20539)菌株基因組擴(kuò)增出D.radioduransR1ytxH基因(DR0105)，基因序列號(hào)為：GeneID：1799501。其大小為492bp，該基因編碼163個(gè)氨基酸，將其克隆于載體pGEMT-easy上，構(gòu)建了含有完整ytxH基因(DR0105)的重組質(zhì)粒pGEMT-ytxH；?

2)將ytxH基因(DR0105)連接于pRADZ3穿梭質(zhì)粒上，該質(zhì)粒含有能在大腸桿菌和耐輻射異球菌中都起作用的groEL啟動(dòng)子，構(gòu)建含有g(shù)roEL啟動(dòng)子的完整ytxH基因重組質(zhì)粒pRADZ3-ytxH?G；?

3)將導(dǎo)入ytxH基因(DR0105)的重組質(zhì)粒pRADZ3-ytxH?G轉(zhuǎn)入受體大腸桿菌JM109中，獲得工程菌株JM-ytxH(見實(shí)施例1)；?

2、含有D.radiodurans?R1ytxH基因工程菌株的耐鹽實(shí)驗(yàn)?

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)4M?NaCl鹽溶液沖擊后，含有D.radiodurans?R1ytxH基因(DR0105)的JM-ytxH重組菌株生長狀況良好，菌落數(shù)高于只含空質(zhì)粒的JM-Z3菌株(見實(shí)施例2及圖4)。該工程菌株具有耐受4M?NaCl沖擊的能力；?

此實(shí)驗(yàn)表明：D.radiodurans?R1ytxH基因(DR0105)具有提高原核生物耐鹽的能力。?

3、ytxH基因(DR0105)在油菜中表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性鑒定?

1)將D.radiodurans?R1ytxH基因(DR0105)連接到植物表達(dá)載體pBI121中，構(gòu)建具有ytxH基因(DR0105)的重組質(zhì)粒pBI121-ytxH；?

2)將pBI121-ytxH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化油菜中，獲得了能夠耐受鹽脅迫的轉(zhuǎn)基因油菜植株；?

此實(shí)驗(yàn)表明：D.radiodurans?R1ytxH基因(DR0105)具有培育耐鹽植物的用途(見實(shí)施例3及圖5)。?

附圖說明：

圖1是含有D.radiodurans?R1ytxH基因(DR0105)序列的PCR產(chǎn)物的驗(yàn)證電泳圖譜；?

圖2是含有D.radiodurans?R1ytxH基因(DR0105)及groEL啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體的構(gòu)建驗(yàn)證電泳圖譜；?

圖3是在鹽沖擊試驗(yàn)前的含有空載體和含有D.radiodurans?R1ytxH基因(DR0105)序列的原核表達(dá)載體的大腸桿菌的生長狀況的菌落照片，其中：?

a是含有空表達(dá)載體的大腸桿菌JM?109菌株；?

b是含有D.radiodurans?R1ytxH基因(DR0105)表達(dá)載體的大腸桿菌重組菌株；?