[發明專利]內毒素檢測及去除關鍵分子中國鱟C因子克隆和序列分析

無效

• 申請號: 201210046141.8
• 申請日: 2012-02-27
• 公開（公告）號: CN103290042A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 牟宗春;高雪超;郭恒昌;莊家麟;周康
• 申請（專利權）人: 上海拜生生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/64;C12N15/10
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技術領域：

本發明涉及生物工程領域，具體是指中國鱟C因子基因的克隆和序列特異性位點分析。?

背景技術：

臨床輸液反應以熱原反應危害最大，發生率最高。內毒素(即革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多糖分子，lipopolysaccharide，LPS)是研究最透徹也是最常見的生物熱原，同時更是各大藥廠必須面對的難題，因為注射時即使是pg級別的痕量LPS，也會導致病人嚴重的熱原反應。因此，靈敏可靠的內毒素診斷技術是非常必須的。?

海鱟的阿米巴樣細胞(amoebocytes)對LPS具有超強敏感性，在革蘭氏陰性細菌入侵時，它能通過一系列的酶促反應，對外來入侵的細菌產生級聯凝集反應，使入侵的微生物失效(1，2)。這一過程(如圖1所示)包括酶原狀態的C因子(Factor?C)識別并結合內毒素而被激活，變成活性酶的狀態后，將下游的B因子激活，活化的B因子將凝固酶原轉化為凝固酶，凝固酶將凝固蛋白原轉化為凝固蛋白，凝固蛋白相互交聯脫水而形成凝膠(3，4)。?

利用海鱟血液阿米巴樣細胞溶解物制成的鱟試劑，能夠準確、快速地定性或定量檢測樣品中是否含有細菌內毒素。自上世紀70年代中期，這一內毒素測試方法開始用于醫藥領域，并且很快被世界各國廣泛采用，中國藥典和歐美藥典將其定為法定的細菌內毒素檢查法。經過幾十年的發展和改良，鱟試劑內毒素檢測法已應用于制藥、醫療器械、非內服制劑、醫藥制品、生物制劑、水質、食品檢測以及科研等各大領域(5)。?

目前世界上僅有四種海鱟，即美國鱟(Limulus?polyphemus)，中國鱟(Tachypleus?tridentatus)，馬來鱟(Tachypleus?gigas)和圓尾鱟(Carcinoscorpius?rotundicauda)。而能夠用于鱟試劑生產的僅有美國鱟和中國鱟兩種，對應的鱟試劑分別稱之為LAL(Limulus?amoebocyte?lysate)和TAL(Tachypleus?Amebocyte?Lysate)，二者反應原理及功效相同，但也存在理化特性的差別，如與內毒素反應的最適pH值等(6)。?

雖然鱟試劑檢測法(LAL/TAL)具有高靈敏度(可檢測飛克級內毒素)、快速等優點，但是由于采用成分復雜的細胞裂解物作為反應原料，同樣具有無法克服的缺陷。比如，非特異性干擾問題：如圖1所示，鱟試劑除了能與內毒素反應外，還會與(1-3)-β-D-葡聚糖反應(1)。(1-3)-β-D-葡聚糖是在真菌、酵母、蘑菇、高等植物中廣泛存在的一種多糖，是構成細胞壁的結構大分子。因此鱟試劑檢測過程中很容易遇到(1-3)-β-D-葡聚糖的非特異性干擾，造成假陽性結果，這對于成分復雜的藥物，尤其是中藥，是一個很大的檢測挑戰(7)。再比如，批次穩定性問題：鱟試劑采用海鱟血液作為生產原料，由于季節、地域等差異，使得鱟試劑的?批次差異成為常見現象。而且，由于環境污染、過度捕撈等原因海鱟的種群數量近年來急劇減少，接近滅絕(8)，使得生產鱟試劑的原材料面臨日益匱乏的危險。?

鱟試劑的主要成分是一系列的絲氨酸蛋白酶原(9，10)，其中C因子在內毒素檢測方法中是關鍵分子，在內毒素介導的鱟血凝集反應系統中，它特異性識別內毒素，并第一個被內毒素激活，從而啟動整個鱟血細胞中的凝集級聯反應(11，12)。因此，以鱟試劑的關鍵分子C因子作為基礎，利用其識別并結合內毒素后，由蛋白酶原被激活為活性酶形式，從而能夠水解發光底物的特點，結合化學/熒光發光定量技術，可以發展出以C因子作為單一成分的內毒素檢測定量技術(13)，與傳統的LAL測定技術比較，重組C因子在相同的分析條件下對內毒素具有更低的背景、更高的靈敏度(14)。?

基于C因子的內毒素檢測技術成分單一，可以使用生物工程技術進行生產和嚴格的質量控制，從而避免了由原材料引起的批次不穩定性，同時保護了海鱟這一古老的“活化石”物種。尤為重要的是，這一新技術消除了傳統鱟試劑對(1-3)-β-D-葡聚糖的非特異性反應，可以大大增強內毒素檢測的特異性，降低“假陽性”結果的發生概率。此外，通過與內毒素的特異結合，重組C因子還可以進一步應用于醫藥產品、生物制品等內毒素去除。綜上，用分子生物學手段克隆C因子基因以應用于內毒素檢測試劑的產品開發，具有重要的臨床意義和巨大的商業價值。?

參考文獻：?

1.Iwanaga，S.(1993)Curr?Opin?Immunol?5，74-82?

2.Muta，T.，and?Iwanaga，S.(1996)Curr?Opin?Immunol?8，41-47?