[發(fā)明專利]用于傳毒分子機制研究的無毒褐色桔蚜飼養(yǎng)方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210046005.9
• 申請日: 2012-02-27
• 公開（公告）號: CN102578047A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設計）人: 劉金香;周常勇;李中安;宋震;李玲娣;王永江
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院柑桔研究所
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所 50211
• 代理人: 郭云

技術領域

本發(fā)明屬于昆蟲飼養(yǎng)領域，具體的說，涉及一種用于傳毒分子機制研究的無毒褐色桔蚜的飼養(yǎng)方法。

背景技術

褐色桔蚜(Toxoptera?citricida，Kirkaldy)，又稱東方桔蚜，屬于同翅目蚜總科Aphidoidea，是一種世界性分布的柑桔害蟲，桔蚜不僅通過直接取食為害柑桔，而且是柑桔衰退病毒(Citrus?tristeza?virus，CTV)的有效傳播介體。柑桔衰退病毒(Citrus?tristeza?virus，CTV)屬于長線形病毒屬(Closterovirus)，是目前已知植物病毒基因組中最大的病毒。柑桔衰退病毒引起的柑桔衰退病是一種具有經濟重要性的病害，廣泛分布于世界各柑桔產區(qū)，對全世界的柑桔產業(yè)造成了嚴重的威脅。

蚜蟲人工飼料研究始于20世紀30年代，蚜蟲人工飼料飼養(yǎng)技術的出現(xiàn)，使得蚜蟲在脫離寄主植物后得以短期或長期存活。蚜蟲人工飼料可應用于蚜蟲傳播病毒機制、營養(yǎng)生理、共生菌、毒理與殺蟲活性物質生物測定以及昆蟲與植物相互關系等方面的研究，已發(fā)展為這些研究的重要試驗手段。

植物病毒介體傳播分子機制的研究，主要集中在病毒參與傳播的基因及其產物的確定。目前在昆蟲傳播病毒分子機制的研究中經常使用的方法之一是：人工飼養(yǎng)昆蟲，使昆蟲在脫離寄植物后能夠正常存活，在飼養(yǎng)液中添加病毒編碼的蛋白質、特異性蛋白抗體或在飼養(yǎng)液中添加病毒提取液、雙鏈RNA，通過比較傳毒率的變化，探討昆蟲傳播病毒的相關因子，對于一些基因組較小的病毒，使用侵染性克隆缺失突變體進行傳毒分子機制的研究，但CTV基因組比較大，構建侵染性克隆缺失突變體比較困難，因此，研究傳毒分子機制時需要蚜蟲在脫離寄主植物后得以短期存活，為研究傳毒分子機制，需要尋找適合褐色桔蚜取食和生存的實用飼料。酵母提取液作為實用飼料的成分之一，一方面可以提供營養(yǎng)，另一方面液體黃色對蚜蟲有引誘作用，有利于蚜蟲取食。糖類是生物體內能量的主要來源，對蚜蟲具有刺激取食和營養(yǎng)雙重作用，不同的蚜蟲所需的蔗糖濃度是不同，目前已對桃蚜和豌豆蚜等不少蚜蟲種類已實現(xiàn)了人工繼代飼養(yǎng)，有桔二叉蚜在人工飼養(yǎng)上飼養(yǎng)1代的報道，但尚無褐色桔蚜人工飼養(yǎng)的資料的報道，而且柑桔衰退病毒的蚜蟲傳播分子機理進展不大。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種無毒褐色桔蚜人工飼養(yǎng)的方法，使蚜蟲在脫離寄主植物后得以短期存活且不影響傳毒效率，以便于無毒褐色桔蚜傳毒分子機制的研究。

本發(fā)明具體按如下步驟進行：

(1)利用無毒柑桔苗進行繼代飼養(yǎng)得到無毒褐色桔蚜：從田間采桔蚜蟲源，以初孵若蚜建立無毒種群，初孵若蚜是指剛出生尚未接觸葉面的蚜蟲，用脫毒柑桔苗或實生苗在養(yǎng)蟲室內飼養(yǎng)褐色桔蚜，養(yǎng)蟲室中設置溫度為25±2℃，光照：黑暗為14∶10h，為了確保連續(xù)有新稍可用于飼養(yǎng)蚜蟲，每兩周修剪20株無毒柑桔苗，追施質量分數(shù)為0.5％尿素或復合肥促發(fā)新稍，若蚜會形成一個群體，群體太多就會產生有翅蚜蟲。為了抑制有翅成蚜的形成和獲得狀態(tài)一致的無翅成蟲，用毛筆輕輕將30頭以上無翅成蟲放在無毒柑桔苗新稍上產下一代若蚜，1～2天后將成蟲轉移到另一無毒苗上，下一代的1～2日齡的無翅成蟲備用。不斷挑用毛筆輕挑無翅成蚜于嫩梢，繼代飼養(yǎng)得到無毒蚜蟲備用；

(2)飼養(yǎng)液的配制與滅菌；飼養(yǎng)液為A或B兩種，飼養(yǎng)液A為去離子水配制，其配制成分為：NaCl?7～10g/L，KCl?0.05～0.2g?g/L，Na₂HPO₄·12H₂O2.9～5g/L，KH₂PO₄?0.05～0.2g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖0～600g/L，pH調節(jié)為7.0～8.0，飼養(yǎng)液A在0.1MPa，121℃下高溫滅菌20分鐘，可在飼養(yǎng)液A中添加用于研究傳毒分子機制的特異性蛋白或者特異性抗體；

上述飼養(yǎng)液B為去離子水配制，其配制成分為：Tris?1.2～2g/L，EDTA0.2～0.37g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖0～600g/L，pH調節(jié)為7.0～8.0，飼養(yǎng)液B在0.1MPa，121℃下高溫滅菌20分鐘，可在飼養(yǎng)液B中添加用于研究傳毒分子機制的病毒提取液或者雙鏈RNA；