[發(fā)明專利]鼠傷寒沙門氏菌的特異性FQ-PCR檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210045529.6
• 申請(qǐng)日: 2012-02-21
• 公開（公告）號(hào): CN102618635A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程安春;黃靜瑋;汪銘書;陳孝躍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/10;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種鼠傷寒沙門氏菌的特異性FQ-PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一，篩選出鼠傷寒沙門氏菌全基因組DNA中的保守且特異性的STM4493基因，其核苷酸序列由SEQ?ID?NO：1定義，并根據(jù)其序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物對(duì)和探針；引物對(duì)和探針序列如下：

上游引物：5-’CCGCGTTTTTGTATTGAAAGTTATC-3’(SEQ?ID?NO：2)

下游引物：5-’AAACATCATGAACGGCCTGG-3’(SEQ?ID?NO：3)

探針：5-’CAGCCAAAACATCAGCAGGCGATCA-3’(SEQ?ID?NO：4)

步驟二，提取樣品DNA；

步驟三，對(duì)樣品DNA進(jìn)行FQ-PCR檢測(cè)；FQ-PCR反應(yīng)體系如下：依次加入10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL，25mmol/L的Mg²⁺2.0μL，2.5mmol/L的dNTP1.0μL，5μM引物對(duì)1μL，5μM探針0.5μL，Taq酶1U，模板溶液0.5～2μL，最后用雙蒸水補(bǔ)至25μL；擴(kuò)增參數(shù)具體為：95℃預(yù)變性5min；之后開始擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的程序?yàn)椋?5℃變性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s；共45個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，降溫至16℃，結(jié)束；

步驟四，通過FQ-PCR儀自帶軟件自動(dòng)分析讀取FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果，判斷樣品是否含鼠傷寒沙門氏菌；所述判斷具體為：若出現(xiàn)Ct＜35且呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的特異性擴(kuò)增曲線，則說明樣品中含鼠傷寒沙門氏菌；若未出現(xiàn)Ct＜35且呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的特異性擴(kuò)增曲線，則說明樣品中不含鼠傷寒沙門氏菌。