[發(fā)明專利]一個(gè)核酸適配子篩選文庫

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210045270.5
• 申請(qǐng)日: 2012-02-27
• 公開（公告）號(hào): CN102732972A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張焜和;張慧卿;張貝;譚新穎;方念;鄔芳玉;呂農(nóng)華;張吉翔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號(hào): C40B40/06
• 分類號(hào): C40B40/06;C12N15/115;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 南昌新天下專利商標(biāo)代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術(shù)領(lǐng)域

本項(xiàng)發(fā)明屬生物分析與工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)自行設(shè)計(jì)的用于核酸適配子篩選的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫及其配套的引物。

背景技術(shù)

核酸適配子（aptamer）是一種生物分子的人工單鏈核酸配體，通過SELEX（Systematic?Evolution?of?Ligands?by?Exponential?Enrichment）技術(shù)從隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫中篩選獲得。核酸適配子與抗體的功能相似，可用于靶分子的識(shí)別，且敏感性和特異性可優(yōu)于抗體。在兩者的制備過程中，核酸適配子在靶標(biāo)方面有明顯的優(yōu)勢。篩選適配子的靶標(biāo)可以小到無機(jī)分子，大到完整的活細(xì)胞，甚至組織，而制備抗體的靶標(biāo)主要為蛋白質(zhì)，且必須具有免疫原性，還不能有毒。因而兩者所針對(duì)的靶分子范圍相差甚遠(yuǎn)。不僅如此，核酸適配子的制備過程本身也較抗體更簡單、不需要體內(nèi)過程、耗時(shí)更短、可人工合成。此外，從核酸適配子與抗體之間理化性質(zhì)的差異也可看到核酸適配子的優(yōu)勢，如性質(zhì)穩(wěn)定、無免疫原性、分子量較小。因而核酸適配子的篩選與應(yīng)用已涉及醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，包括基礎(chǔ)研究、臨床診斷、疾病治療和藥物研發(fā)等方面。

SELEX技術(shù)是一種組合化學(xué)新技術(shù)，自1990年問世以來受到廣泛關(guān)注，發(fā)展迅速。它利用人工合成的大容量隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫與靶分子相互作用，從中篩選出能與靶分子特異結(jié)合的單鏈寡核苷酸，并借助PCR擴(kuò)增技術(shù)使之指數(shù)富集，最終獲得能與靶分子高特異性、高親和力結(jié)合的核酸適配子。核酸適配子的SELEX篩選的基本步驟如下：設(shè)計(jì)并合成隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫及配套的引物；將靶標(biāo)與文庫共孵育，使文庫中能與靶標(biāo)特異性結(jié)合的寡核苷酸與靶標(biāo)形成復(fù)合物，分離后者并洗脫寡核苷酸；以洗脫的寡核苷酸作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備出新的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫（亞文庫），開始下一輪篩選；通過重復(fù)數(shù)輪篩選與擴(kuò)增，能與靶標(biāo)高特異性和高親和力結(jié)合的寡核苷酸留在文庫中并被指數(shù)富集；對(duì)最后一輪篩選后制備的文庫進(jìn)行克隆、測序，其中長度及兩端固定序列與文庫相符的寡核苷酸即為核酸適配子；測定各核酸適配子與靶標(biāo)結(jié)合的特異性和親和力，選出特異性強(qiáng)、親和力大的核酸適配子應(yīng)用于靶標(biāo)的檢測分析。

核酸適配子篩選過程中所用文庫中的單鏈寡核苷酸兩端為固定序列，中間為隨機(jī)序列。固定序列為引物提供結(jié)合部位，便于SELEX篩選過程中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，富集特異性序列和制備下一輪篩選用的亞文庫。隨機(jī)序列是文庫中核酸序列多樣性的基礎(chǔ)，隨機(jī)區(qū)越長，多樣性越豐富。隨機(jī)區(qū)長度一般為30個(gè)核苷酸左右，此時(shí)文庫容量實(shí)際上能達(dá)到10^14-15（理論上30⁴＝1.15¹⁸），延長隨機(jī)區(qū)可增加文庫序列及其分子構(gòu)象的多樣性，但會(huì)明顯影響PCR擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)物的特異性。另外，固定序列的長度則與文庫多樣性成反比，在總長度一定的情況下，縮短固定序列長度，則可延長隨機(jī)序列的長度，有利文庫有更好的多樣性。單鏈寡核苷酸的一個(gè)獨(dú)特表現(xiàn)是容易形成各種形狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾、口袋、假結(jié)、凸環(huán)、G-四聚體（G-quartet）等，通過分子構(gòu)象上“鎖鑰”匹配，加上氫鍵、范德華力等作用，可與靶分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物。10^14-15的巨大庫容所擁有的豐富的寡核苷酸分子構(gòu)象，被認(rèn)為可為自然界存在的幾乎所有分子找到構(gòu)象匹配的單鏈寡核苷酸配體（核酸適配子）。

通過SELEX技術(shù)篩選靶標(biāo)的核酸適配子的原理和技術(shù)都不復(fù)雜，但要成功篩選到理想的核酸適配子卻并不簡單，其中隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫序列的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵因素。在SELEX篩選的每一輪中，都要進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，以富集能與靶標(biāo)相對(duì)特異結(jié)合的單鏈寡核苷酸序列。一般而言，隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)有一個(gè)非常獨(dú)特的現(xiàn)象，就是隨著循環(huán)次數(shù)的增加，各種大小不一的非特異性產(chǎn)物迅速增多，而且目的條帶不斷減少，從而嚴(yán)重干擾亞文庫的制備，甚至導(dǎo)致篩選失敗。造成這一特殊現(xiàn)象的原因主要是文庫的隨機(jī)序列的存在，因文庫的序列多樣性達(dá)10^14-15，單鏈寡核苷酸之間的部分堿基局部性相互配對(duì)難以避免，引物與某些寡核苷酸之間的錯(cuò)配也難以消除。要減少寡核苷酸相互配對(duì)和引物錯(cuò)配，理論上可以縮短隨機(jī)序列的長度。然而，從文庫中篩選能與靶分子構(gòu)象適配的單鏈寡核苷酸（核酸適配子），其前提是文庫中的寡核苷酸序列分子構(gòu)象多樣性必須足夠，也就是說文庫的中間隨機(jī)序列必須足夠長，才有可能形成豐富分子構(gòu)象。因此，在核酸適配子篩選時(shí)的首要問題是設(shè)計(jì)一個(gè)隨機(jī)序列長度足夠的文庫，在這個(gè)前提下，改善文庫的PCR擴(kuò)增特性，既能有效獲得目的產(chǎn)物，又能有效抑制非特異性產(chǎn)物形成，這是成功篩選到理想的核酸適配子的關(guān)鍵。