[發明專利]用于蘇丹紅Ⅰ和對位紅檢測的單克隆抗體及酶聯免疫方法與試劑盒

無效

• 申請號: 201210045215.6
• 申請日: 2012-02-27
• 公開（公告）號: CN102585008A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 袁宗輝;張麗燕;彭大鵬;王玉蓮;潘源虎;陳冬梅;陶燕飛;黃玲利;戴夢紅;劉振利
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C12N5/20;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 樊戎

技術領域

本發明涉及一種能識別蘇丹紅Ⅰ蘇丹紅Ⅰ和對位紅的單克隆抗體和一種用于動物源性食品中蘇丹紅Ⅰ蘇丹紅Ⅰ和對位紅檢測的酶聯免疫方法(ELISA)與試劑盒。?

背景技術

蘇丹紅染料和對位紅均屬于偶氮類染料，是常見的紅色染料，由于這類染料含有芳香族結構，進人人體后可被分解還原成芳香胺，形成致癌的芳香胺化合物，嚴重危害到人類健康。研究表明，蘇丹紅Ⅰ蘇丹紅Ⅰ是一種潛在的致癌劑，可引發鼠肝臟、膀胱和脾臟等臟器的腫瘤，因此，國際癌癥研究中心將其列為三類致癌物。對位紅也被懷疑具有致癌性，自1995年起，包括我國在內的許多國家均頒布了法律禁止這類物質作為食品添加劑使用。?

因此，建立分析方法以監控蘇丹紅和對位紅的違法使用尤顯重要。目前HPLC是最常用的方法，但是需要配備昂貴的儀器和專業性強的操作人員，樣品的前處理復雜，檢測時間長，不利于大批量樣品的篩選，不能在現場進行快速的檢測。?

相對于儀器分析法，免疫學分析法具有操作簡單、快速、靈敏度高、特異性強、檢測費用低等優點，適用于大批量樣品的初篩，目前對于蘇丹紅和對位紅的免疫學檢測方法較少。申請號為200810201463.9的中國專利公開了一種單克隆抗體的制備及其用途，該專利以羧基蘇丹紅為半抗原，分別以牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)為載體蛋白與半抗原偶聯制備免疫原和包被原；經動物免疫和細胞篩選，獲得了保藏編號為CCTCC?NO：C200813的單克隆細胞株，該細胞株分泌的單克隆抗體與蘇丹紅Ⅰ蘇丹紅Ⅰ和對位紅的交叉反應率分別為100％和20％，可用于番茄醬等食品中蘇丹紅Ⅰ蘇丹紅Ⅰ的檢測。?

發明內容

本發明的第一個目的在于提供一種能識別蘇丹紅Ⅰ蘇丹紅Ⅰ和對位紅的單克隆抗體。?

本發明的第二個目的是利用該單克隆抗體，建立一種能檢測動物原性食品中蘇丹紅Ⅰ蘇丹紅Ⅰ和對位紅的酶聯免疫方法。?

本發明的第三個目的是提供一種能檢測動物源性食品中蘇丹紅Ⅰ蘇丹紅Ⅰ和對位紅的酶聯免疫試劑盒。?

本發明的第四個目的是提供所述單克隆抗體在制備檢測動物源性食品中蘇丹紅Ⅰ蘇丹紅Ⅰ和對位紅的酶聯免疫試劑盒中的應用。?

本發明的第五個目的是提供含有所述單克隆抗體的試劑盒在動物源性食品中蘇丹紅Ⅰ蘇丹紅Ⅰ和對位紅檢測中的應用。?

本發明是通過以下技術方案實現的：?

一種能識別蘇丹紅Ⅰ蘇丹紅Ⅰ和對位紅的單克隆抗體，它是由保藏號為CCTCCNO：C201185的雜交瘤細胞SU?I/1H7所分泌的。?

上述雜交瘤細胞SU?I/1H7，保藏在位于湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCC?NO：C201185。?

所用的免疫原是由半抗原1-(4-羧基苯偶氮基)-2-萘酚與牛血清白蛋白偶聯制備的。?

進一步，本發明提出了一種適用于蘇丹紅Ⅰ蘇丹紅Ⅰ和對位紅檢測的酶聯免疫方法，具體步驟如下：?

(1)將半抗原1-(4-羧基苯偶氮基)-2-萘酚與牛血清白蛋白偶聯得到免疫原；?

(2)將半抗原1-(4-羧基苯偶氮基)-2-萘酚與卵清蛋白偶聯得到包被原；?

(3)利用步驟(1)的免疫原免疫小鼠，通過細胞融合與篩選得到保藏號為CCTCC?NO：C201185的雜交瘤細胞SU?I/1H7；?

(4)用保藏號為CCTCC?NO：C201185的雜交瘤細胞SU?I/1H7制備單克?隆抗體；?

(5)用步驟(2)的包被原包被固相載體(如酶標板)；?

(6)稱取均質后的動物組織樣品，用乙腈提取后，取乙腈層用氮氣吹干，殘渣用含0.05體積％吐溫20的10mM?PH為7.4的三羥甲基胺基甲烷-HCl溶液(Tris-HCl溶液)溶解，得到待測物；?

(7)取待測物進行酶聯免疫檢測。?

步驟(6)含0.05體積％吐溫20的10mM?PH為7.4的三羥甲基胺基甲烷-HCl溶液(Tris-HCl溶液)的配制方法為：準確稱取三羥甲基胺基甲烷(Tris)1.211g，加入少量水攪拌溶解完全，至950mL，攪拌條件下用濃鹽酸調pH值至7.4，再加0.5mL吐溫20溶解，定容至1000mL。?

本發明以上述單克隆抗體和包被原作為核心試劑與常規的其他試劑組合，制成了能檢測動物源性食品中蘇丹紅Ⅰ蘇丹紅Ⅰ和對位紅的酶聯免疫試劑盒，結合上述酶聯免疫方法，實現了對動物源性食品中蘇丹紅Ⅰ蘇丹紅Ⅰ和對位紅的酶聯免疫檢測。?