[發明專利]一種TaqMan探針實時熒光RT-PCR檢測甲病毒的非診斷性方法

有效

• 申請號: 201210045090.7
• 申請日: 2012-02-24
• 公開（公告）號: CN102559936A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 孫肖紅;郭金金;燕清麗;姚李四;劉麗娟;楊宇;王旺
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京中創陽光知識產權代理有限責任公司 11003
• 代理人: 尹振啟

技術領域

本發明涉及一種TaqMan探針實時熒光RT-PCR檢測甲病毒的非診斷性方法。

背景技術

披膜病毒科甲病毒屬病毒與黃病毒科黃病毒屬病毒、呼腸孤病毒科病毒和布尼亞病毒科病毒均屬于蟲媒病毒，蟲媒病毒是指通過吸血的節肢動物叮咬敏感的脊椎動物而引起的一種人獸共患的自然疫源性疾病。人、畜一旦被攜帶病毒的節肢動物叮咬感染，就會帶來疾病和死亡，當病毒大面積爆發時，會給爆發地經濟帶來巨大損失，引起社會恐慌，是各國公共衛生機構都有可能面臨的問題。

目前，甲病毒主要的鑒定手段是病毒分離，但是由于其對實驗條件要求苛刻、操作較復雜、技術難度高并且在檢測時間長的同時伴隨著嚴重的生物安全問題，所以無法再實際檢測工作中推廣使用。

近年來使用常規反轉錄PCR擴增(retro-transcript-PCR，RT-PCR)及實時熒光定量PCR(Real-time?PCR)技術在甲病毒的檢測方面發揮了重要作用。但目前使用的RT-PCR、實時熒光PCR大多只是針對某一種蟲媒病毒的檢測。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種快速、敏感的檢測和篩選甲病毒屬病毒的TaqMan探針實時熒光RT-PCR檢測甲病毒的非診斷性方法。

為實現上述目的，本發明一種TaqMan探針實時熒光RT-PCR檢測甲病毒的非診斷性方法，該非診斷性方法包括：

設計了一對引物和探針對待檢樣本進行實時定量檢測，引物和探針序列如下：

進一步，所述探針連接的熒光基團為TXR-BHQ2，熒光探針5’端標記的熒光報告基團是TXR，3’端連接淬滅基團。

進一步，所述該淬滅基團為BHQ2非熒光淬滅基團。

進一步，所述該非診斷性方法包括步驟：

1)樣本用裂解液和RNA抽提液處理，提取病毒RNA；

2)實時熒光RT-PCR反應，配制一定組分濃度的25μLPCR反應體系，混勻后短暫離心分裝到PCR管中；

3)將待測樣品加入到反應體系中，進行擴增；

4)收集熒光信號，檢測Ct值。

進一步，所述實時熒光RT-PCR反應的體系組分及其體積如下：

擴增條件：采用本領域的標準擴增條件。

本發明的有益效果在于：采用TaqMan探針實時熒光RT-PCR(Real-time?PCR)檢測甲病毒的非診斷性方法，該非診斷性方法包括設計一對引物和探針對待檢樣本進行實時定量檢測，利用了PCR對DNA的高效擴增，探針技術的高特異性和光譜技術的敏感性以及定量的特點，克服常規PCR檢測的不足，具有直觀、高度特異性、檢測時速度快、步驟簡單、重復性好、靈敏度高、可進行多重定量的特點。在實際快速診斷中有極強的操作性。

附圖說明

圖1為蓋塔病毒RNA擴增曲線；

圖2為基孔肯雅病毒RNA擴增曲線。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡釋本發明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明要求保護的范圍，下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。

實施例中所使用的引物和探針序列如下：

實施例1

1.待檢樣品為蓋塔病毒感染的細胞上清，陽性對照為體外轉錄的蓋塔病毒mRNA，陰性對照為RNase-Free?Water。

2.細胞上清RNA的提取：按QIAamp?Viral?RNA?Mini?Kit使用說明書提取樣品RNA。

具體操作步驟如下：

①根據樣本的數量分裝裂解液AVL，每管560μl；

②取140μl病毒液加入到560μl分裝好的AVL，渦旋震蕩15秒，充分混勻，室溫孵育10分鐘；

③每管分別加入560μl的無水乙醇(96％-100％)，震蕩15秒充分混勻，快速離心；

④從試劑盒中取出帶濾柱的2ml的收集管，打開包裝，做好標記。取步驟③中的混合液630μl加入到收集管中，8000rpm離心1分鐘；

⑤將濾柱放置到新的2ml收集管中，將剩余的混合液全部吸入到濾柱中，8000rpm離心1分鐘；

⑥取一個干凈的2ml收集管，將濾柱移至新的收集管中，加入500μl洗脫液AW1，8000rpm離心1分鐘；