[發明專利]一種提高釀酒酵母分泌表達異源蛋白的方法及專用釀酒酵母菌株

有效

• 申請號: 201210044319.5
• 申請日: 2012-02-25
• 公開（公告）號: CN102559740A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 鮑曉明;沈煜;徐麗麗
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

技術領域

本發明涉及一種提高酵母分泌表達異源蛋白的方法，尤其是針對分子量大且二硫鍵豐富的異源蛋白的方法及專用提高釀酒酵母異源蛋白分泌表達的菌株。

背景技術

近年來，以釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)作為宿主菌表達異源蛋白日益引起重視，釀酒酵母作為低等真核生物具有非致病性，快速分裂，容易培養，基因操作簡單等優勢，并且具備將異源蛋白進行正確加工，修飾，合理的空間折疊等功能，然而，仍然存在很多瓶頸如低分泌效率和過度糖基化等，制約了異源蛋白在釀酒酵母中的分泌表達。影響異源蛋白分泌效率的主要因素有：目的蛋白本身的性質，密碼子偏好性，載體，啟動子，信號肽，蛋白質合成、折疊和分泌過程，受體菌和培養條件(Niebauer?RT?and?Robinson?AS，In：Baneyx?F(ed)Protein?expression?technologies.Horizon，Norwich；2005：253-296.)。在這些影響因素中蛋白質合成、折疊和分泌過程有可能是限速步驟。在內質網腔中，分子伴侶和助折疊因子促進蛋白質加工折疊成正確的結構，是限速步驟之一，有研究報道過表達內質網分子伴侶或者非折疊應答途徑(UPR)的組分可以促進蛋白分泌(Ji?L?et?a1.，Bioresour?Technol?2011，102(17)：8105-8109；Ilmén?M?et?al.，Biotechnol?Biofuels?2011，4：30)。另外一個限速步驟是蛋白質運輸過程，有許多研究結果表明敲除介導高爾基體到囊泡的蛋白質誤分揀途徑的囊泡蛋白分揀受體Sc-VPS10基因，可以促進異源蛋白分泌(Hong?E?et?al.，J?Cell?Biol?1996，135：623-633；Holkeri?H?and?Makarow?M，FEBS?Lett?1998，429：162-166；Zhang?B?et?al.，J?Cell?Biol?2001，153：1187-1198)；另外過表達參與高爾基體產生的分泌小泡與質膜融合的t-SNARE基因Sc-SSO1，可以提高異源蛋白分泌表達(Ruohonen?L?et?al.，Yeast?1997，13(4)：337-351；Larsson?S?et?al.，Appl?Environ?Microbiol?2001，67(3)：1163-1170)。

纖維素乙醇是有潛力的未來燃料，纖維素乙醇的生產需要纖維素水解微生物和糖發酵微生物的協作。CBP(Consolidated?bioprocessing)是將纖維素酶和半纖維素酶生產、纖維素水解和乙醇發酵過程組合或部分組合，通過一種微生物完成。CBP過程有利于降低生物轉化過程的成本，越來越受到研究者的普遍關注。一個成功的CBP菌株不僅需要強有力的乙醇發酵能力，還需要纖維素水解能力。作為傳統的乙醇生產菌株，釀酒酵母被認為是良好的CBP載體(Lynd?LR?et?al.，Microbiol?Mol?Biol?Rev?2002，66(3)：506-577.)。構建釀酒酵母CBP菌株的主要策略是在釀酒酵母中高效分泌表達木質纖維素水解酶(Lynd?et?al.，Microbiol?Mol?BiolRev?2002，66(3)：506-577)。