[發(fā)明專利]高產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶菌株的復(fù)篩方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210043493.8
• 申請日: 2012-02-24
• 公開（公告）號: CN102586123A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 熊鵬;周玉珍;呂睿瑞;熊濤
• 申請（專利權(quán)）人: 熊鵬
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14
• 代理公司: 淮安市科翔專利商標(biāo)事務(wù)所 32110
• 代理人: 韓曉斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及菌株的篩選方法，具體涉及一種高產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶菌株的復(fù)篩方法。

背景技術(shù)

木質(zhì)纖維素是世界上儲量大并具備可再生能力的天然環(huán)保型資源，每年全世界木質(zhì)纖維素的產(chǎn)量每年約有750億噸。在環(huán)境污染和化石能源日漸枯竭的現(xiàn)代社會(huì)，利用木質(zhì)纖維素資源替代化石能源成為目前亟待解決的問題。木質(zhì)纖維素的降解是木質(zhì)纖維素資源利用的最大困難。世界各國已投入巨大的人力財(cái)力進(jìn)行木質(zhì)纖維素降解的研究，通過微生物篩選，誘變，酶的純化，基因克隆及表達(dá)，宏基因組學(xué)，宏蛋白質(zhì)組學(xué)等方法，從理論研究到實(shí)際應(yīng)用希望能找出解決木質(zhì)纖維素降解這一難題的突破口。

為了有效的利用這樣大量廉價(jià)環(huán)保的資源，我們首先要了解天然的木質(zhì)纖維素的組成和結(jié)構(gòu)。除棉花外，絕大多數(shù)天然的木質(zhì)纖維素的實(shí)質(zhì)就是大量的植物纖維細(xì)胞壁的集合，主要是由纖維素（cellulose），半纖維素(hemicellulose)，木質(zhì)素(lignin)三類物質(zhì)組成的，這三類物質(zhì)在天然木質(zhì)纖維素中的含量為纖維素40%-50%，半纖維素20-35%,木質(zhì)素20%-30%。其中以纖維素為骨架物質(zhì)，半纖維素和木質(zhì)素為包裹組分和包埋組分，它們之間通過共價(jià)鍵和化學(xué)鍵緊密連結(jié)在一起。

天然木質(zhì)纖維素的組成復(fù)雜，因此微生物降解天然木質(zhì)纖維素也是分泌一系列針對不同組分的酶協(xié)同作用，共同降解木質(zhì)纖維素，這些酶主要分為纖維素降解酶，半纖維素降解酶和木質(zhì)素降解酶類。纖維素酶是一類能夠作用于纖維素最終生成葡萄糖的酶的總稱，一般纖維素酶有十幾個(gè)到幾十個(gè)組分，這些組分可分為三大類：葡聚糖內(nèi)切酶(endo-glucanases,EG?)，葡聚糖外切酶或纖維二糖水解酶(exo-glucanases?or?cellobiohydralases,?CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases)。半纖維素中最具代表性的一種就是木聚糖，在植物細(xì)胞壁中的含量僅次于纖維素，因此對于木聚糖酶系的組成研究的比較清楚。木聚糖酶系包括：β-內(nèi)切木聚糖酶（endo-beta-xylanase），β-木糖苷酶（beta-xylosidase），α-葡萄糖醛酸酶（alpha-glucuronidase），乙酰木聚糖酯酶（Acetylxylan?esterase），阿魏酸酯酶（feruloyl?esterase），α-阿拉伯呋喃糖酶（alpha-N-arabinofuranosidase），葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶（glucan?1,4-alpha-glucosidase）。木質(zhì)素降解酶類主要有三種：木質(zhì)素過氧化物酶（Lignin?peroxidase，簡稱Lip）、錳過氧化物酶（Mn-dependent?peroxidase，簡稱MnP）和漆酶，此外還有HRP、CDH?等酶類。自然界中能夠降解木質(zhì)纖維素的菌種類很多，目前已經(jīng)分離篩選出的能夠產(chǎn)生木質(zhì)纖維素降解酶的細(xì)菌有梭菌屬(Clostridium)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、桿菌屬(Bacillus)、擬桿菌(Bacteroides)、高溫單胞菌屬(Thermomonospora)、歐文氏菌屬(Erwinia)、醋弧菌屬(Acetovibrio)等。真菌主要有木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、白腐真菌(P?chrysosporium)、白絹菌(Sclerotium?rolfsii)以及裂殖菌屬(Schizophyllum)等。放線菌主要有鏈霉屬、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)等。對這些微生物進(jìn)行傳統(tǒng)的育種改造，能夠有效提高酶活，改善酶的特性，用于工業(yè)生產(chǎn)。

微生物降解纖維素的酶類基本都屬于誘導(dǎo)型酶，根據(jù)目前的研究，不同的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素降解酶系種類及比例是不同的。目前的報(bào)道中，用可溶性的山梨糖（Sorbose），乳糖（Lactose）和槐糖（Sophorose），以及一些不溶性碳源如純的微晶纖維素、木聚糖、預(yù)處理的木質(zhì)纖維素、牛糞、玉米纖維，誘導(dǎo)促使微生物產(chǎn)酶，但在工業(yè)生產(chǎn)中，這些原料價(jià)格昂貴，并不經(jīng)濟(jì)實(shí)用，因此只有使用工業(yè)原料的誘導(dǎo)物來誘導(dǎo)產(chǎn)酶，才能在生產(chǎn)中更具有針對性。

一般篩選是通過微生物在以纖維素作為碳源的平板培養(yǎng)基形成的透明圈大小來判定其纖維素酶活或該微生物對纖維素的降解能力，該方法需要預(yù)先將色素與纖維素結(jié)合，或在微生物培養(yǎng)后進(jìn)行染色脫色步驟，如果是在微生物培養(yǎng)后進(jìn)行染色還需要將菌種備份，這樣操作步驟非常繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容