[發明專利]小鼠皮膚黑色素細胞特異表達的載體及其應用

無效

• 申請號: 201210042944.6
• 申請日: 2012-02-24
• 公開（公告）號: CN102776234A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 范瑞文;董常生;白俊明;楊姍姍;謝建山;冀元凱
• 申請（專利權）人: 山西農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬生物技術領域，具體而言涉及一種在皮膚黑色素中特異表達，從而為產生轉基因動物提供高效表達的載體。

背景技術

CDK5-A是CDK家族成員，研究表明CDK5-A通過調節羊駝黑色素細胞產生黑色素的路徑上TYR和MC1R等基因的表達，參與羊駝毛色形成，并在其表型和功能的維持中起重要的作用。為了將羊駝CDK5-A轉入絨山羊使其毛色表型發生變化成為可能，載體中承載的可表達序列(包含啟動子、報告基因、FLAG標簽以及目標基因)的構建是前提。

該構建技術主要應用DNA重組技術定向地將不同的DNA片段進行連接，在特定的受體細胞中與載體同時復制進行表達，從而產生新的目的遺傳性狀。該構建的目的是將CDK5-A基因接入真核表達載體中，通過自身攜帶的特異啟動子以及在哺乳動物細胞內表達的真核啟動子使目的基因在特異細胞中表達。在設計該構建時根據目的而對所涉及的DNA片段進行修飾和改造。

構建轉基因小鼠的表達載體，理想的應該是帶內含子的基因組DNA，可是，由于一般基因組DNA都比較長，獲取完整而又正確的序列非常困難，所以一般情況下用的是cDNA。而且，制備轉基因載體構建時，首先必須將導入DNA進行分離純化，并線性化。而在使用的載體上除了多克隆位點之外，還有很多其它酶切位點的，故用限制性內切酶進行酶切可以使DNA線性化。另外，還可以通過在設計的引物上額外加上限制性內切酶酶切位點，也可以解決該問題。

為了體現目標基因是否進行表達，在載體上需要一個報告基因，這樣報告基因的一個優點是它可以區分轉錄體是來源于轉染的質粒還是來源于內源性基因。同時，報告基因常含有一個Kozak一致序列(即該序列含有真核生物翻譯起始密碼子)，并在下游含有多聚A信號，因此在RNA聚合酶II作用下產生的mRNA能翻譯為蛋白質。報告基因編碼區的上游插入了啟動子，是DNA分子報告基因的mRNA、蛋白質或酶水平可以反應啟動子的活性。

對于細胞特異性啟動子而言，啟動子活性在表達的細胞系中與其在非表達的細胞系中具有很大差異，因此，為了使構建在特異的細胞中表達，選擇細胞內特異的啟動子是必要的。

目的基因在特異細胞中表達后，為了分析蛋白質的生物學功能以及篩選目的基因暫時不容易得到或特異細胞轉染效率低的基因靶點，常在氨基端加一FLAG標簽。Flag標簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽(DYKDDDDK)，一般不與目的蛋白發生相互作用，并且不會影響目的蛋白的生物活性和細胞內定位，這樣利于對其進行下游研究。

發明內容

本發明為了提高CDK5在黑色素細胞中的表達效率，構建了含有CDK5的載體。為了實現本發明的目的，本發明采用如下的技術方案：

本發明一方面涉及一種載體，其序列結構為pMD18-T-TYRP2-CDK5-SV40intron/polyA，優選的，其含有SEQ?ID：7的DNA序列。

本發明另一方面還涉及一種試劑盒，其含有上述載體，優選的，在本發明的試劑盒中還包括輔助基因轉染的試劑。

本發明另外一方面還涉及制備上述載體的試劑盒，其包括SEQ?ID：1-6的引物。

本發明另一方面還涉及上述載體的用途，其特征在于所述的載體用于體外黑色素細胞的轉染。

另一方面，本發明還涉及上述載體在調節動物黑色素表達中的應用，所述的應用是非治療目的的。

具體實施方式

(1)克隆小鼠TYRP2基因的啟動子片段

以小鼠基因組DNA為模板，PCR法擴增獲得，經純化后，進行TA克隆。

所用引物如下：

Try2P-F(SEQ?ID：1)：5’CGAGCTCGTAAATGCACACATCTGCATGC?3’?(Sac?I)

Try2P-R(SEQ?ID：2)：5’GCCCGGGGCCGGCGTCCCACCTGGTTTC?3’??(Xma?I)

(2)克隆羊駝CDK5?cDNA片段，并帶有FLAG標簽

以羊駝cDNA為模板，引物中設計FLAG序列，PCR法擴增獲得，經純化后，進行TA克隆。

所用引物如下：

CDK5-Kozak-F(SEQ?ID：3)：5’GCCCGGGGCCGCCACCATGCAGAAATACGAGAAACTGG?3’(Xma?I)