[發明專利]一株枯草芽孢桿菌工程菌及其在生產肝素酶Ⅰ中的應用

有效

• 申請號: 201210042866.X
• 申請日: 2012-02-24
• 公開（公告）號: CN102533628A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 王鳳山;李瀟;孫永福;李娜;周帥
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12N9/88;C12P19/04;C12R1/125
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

1.一株枯草芽孢桿菌工程菌，其特征在于：菌株名為WB600(pBE2-S-H)，分類命名為：枯草芽孢桿菌Bacillus?subtilis，已于2012年02月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?NO.5757。

2.一種枯草芽孢桿菌工程菌的構建方法，其特征在于：是通過將肝素黃桿菌肝素酶Ⅰ的編碼基因轉入枯草芽孢桿菌中，篩選得到的能夠分泌表達肝素酶Ⅰ的菌株。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于：所述肝素酶Ⅰ的編碼基因如SEQ?ID?NO.1或2所示。

4.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于：所述肝素酶Ⅰ的編碼基因5′-端連接有6×His標簽。

5.根據權利要求2～4中任一項所述的構建方法，其特征在于：步驟為：

(1)利用HindⅢ和BamH?Ⅰ分別雙酶切重組質粒SacB/pGEM-T?Easy和質粒pBE2，回收SacB(H/B)和pBE2(H/B)，將二者用T4?DNA連接酶連接；

(2)連接產物轉化大腸桿菌TG1感受態細胞，篩選陽性克隆并用PCR及質粒雙酶切鑒定重組質粒pBE2-S，獲得重組質粒pBE2-S；

(3)利用BamH?Ⅰ和EcoR?Ⅰ分別雙酶切重組質粒HepA/pGEM-T?Easy和質粒pBE2-S，回收HepA(B/E)和質粒pBE2-S(B/E)，將二者用T4?DNA連接酶連接；

(4)連接產物轉化大腸桿菌TG1感受態細胞，篩選陽性克隆并用PCR及質粒雙酶切鑒定重組表達質粒pBE2-S-H，最終獲得重組表達質粒pBE2-S-H；

(5)以空質粒pBE2-S為陰性對照，利用電轉化法將測序正確的重組表達質粒pBE2-S-H轉化枯草芽孢桿菌WB600感受態細胞，在卡那霉素抗性的LB平板上培養24h，挑取陽性轉化子單菌落擴增，提取重組質粒，進行質粒PCR驗證，獲得含pBE2-S-H的轉化子WB600；

(6)發酵上述所得到的含pBE2-S-H的轉化子WB600，鑒定產物并進行活性測定，若肝素酶Ⅰ活性達13000U/L發酵液以上，即得到能夠分泌表達肝素酶Ⅰ的枯草芽孢桿菌工程菌。

6.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于：所述步驟(5)中，電轉化法的條件是：電壓2kV，電容25μF，電阻200Ω，電擊時間4～5ms。

7.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于：所述步驟(6)中，發酵的條件是：37℃，200～220r/min培養24h。

8.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于：所述步驟(6)中，鑒定產物的方法是通過SDS-PAGE進行的。

9.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌工程菌在生產肝素酶Ⅰ中的應用。

10.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌工程菌在低分子肝素生產中的應用。