[發(fā)明專利]一種克隆細菌基因cDNA全長的方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201210041168.8 | 申請日： | 2012-02-22 |
| 公開（公告）號： | CN102559664A | 公開（公告）日： | 2012-07-11 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張曉;于源華;王保學(xué);張昊;姚健;張淑華;何秀霞;葛淑敏 | 申請（專利權(quán)）人： | 長春理工大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10;C12N15/31;C12N15/53;C12N15/57;C12R1/01;C12R1/19 |
| 代理公司： | 長春眾益專利商標事務(wù)所(普通合伙) 22211 | 代理人： | 紀尚 |
| 地址： | 130022 吉林省長春市衛(wèi)*** | 國省代碼： | 吉林;22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 克隆 細菌 基因 cdna 全長 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物基因技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
目前，基因功能研究已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的重要課題，而獲得基因的cDNA全長是研究基因功能的基礎(chǔ)。獲得基因cDNA全長后，可以明確基因啟動子的位置以及基因的結(jié)構(gòu)，從而為進一步研究基因功能奠定基礎(chǔ)。
但長期以來，克隆基因cDNA全長一直是個難點。目前，獲得基因cDNA全長的方法主要有：RACE(rapid?amplification?of?cDNA?ends)法，cDNA文庫法，S1?nuclease?mapping法，primer?extension法等。但是，5’RACE操作步驟復(fù)雜，需要進行去掉Total?RNA中5’裸露的磷酸基團、去掉mRNA的5’帽子結(jié)構(gòu)、連接5’RACE?Adaptor、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA等步驟。其中，前3步均是在RNA水平的操作，步驟繁瑣、耗時長，而mRNA極易降解，因此對操作的要求較高；同時5’RACE對總RNA質(zhì)量和純度的要求較高。且5’RACE試劑盒價格昂貴，實驗成本很高。而細菌mRNA通常無polyA，這使得3’RACE難以成功。cDNA文庫法需要繁瑣的建庫、篩庫步驟。S1?nuclease?mapping和primer?extension需要放射性同位素和特殊的儀器，而一般實驗室不具備此實驗條件。上述方法步驟繁瑣，費用昂貴，并且一次只能克隆一個基因的cDNA全長，無法同時對多個基因的cDNA全長進行克隆，比如RACE、S1?nuclease?mapping、primer?extension法一個反應(yīng)只能獲得5’UTR或3’UTR一個方向的序列。因此，需要開發(fā)一種經(jīng)濟、便捷、高效克隆基因cDNA全長的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是：提供一種克隆細菌基因cDNA全長的方法，該方法不僅能夠一次同時獲得基因的5’UTR和3’UTR序列，而且可以同時對多個基因的cDNA全長進行克隆，并且成本低廉。
本發(fā)明的另一個目的是：提供一種克隆細菌基因cDNA全長的方法在克隆細菌基因cDNA全長中的應(yīng)用。
本發(fā)明的方法是：環(huán)化RT-PCR法。
其步驟是：
(1)總RNA的提?。豪眉毦俁NA提取試劑盒或TRIzol試劑提取細菌總RNA。
(2)總RNA的自連環(huán)化：自連環(huán)化按如下方法進行：取總RNA?3-5μg(約5-8μL)，T4?RNA連接酶buffer?2μL，T4RNA連接酶5U，DNA酶抑制劑1μL，加dd?H2O(無RNase)至20μL。16℃連接20h后，將連接產(chǎn)物用10μL氯仿抽提一次(利用PCR管進行抽提)，然后用2.5倍體積無水乙醇沉淀RNA，用5μL?ddH2O重溶RNA備用。
(3)第一鏈cDNA的合成：將自連環(huán)化的總RNA，利用六核苷酸隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA；所述逆轉(zhuǎn)錄按如下方法進行：分別將5μL環(huán)化RNA，1μL?random?primer(10pmol/μL)和5μL?ddH2O于65℃水浴5min后，放置于冰上；加入5×RT?buffer?4μL，dNTP?mixture(各10mM)2μL，RNase?inhibitor(10U/μL)1μL，ReverTra?AceR?1μL。將上述20μL反應(yīng)體系42℃水浴放置90min使逆轉(zhuǎn)錄完成；85℃水浴5min使酶失活，4℃冷卻后瞬時離心。
(4)雙鏈cDNA的合成。針對目的基因設(shè)計反向引物(inverse?primer，IP)，朝向5’UTR和3’UTR的引物分別命名為IP1和IP2。以合成的第一鏈cDNA為模板，以IP1和IP2為引物，進行PCR反應(yīng)，同時獲得基因5’UTR和3’UTR序列。
(5)雙鏈cDNA片段的連接與測序。將步驟(4)中所述的PCR產(chǎn)物連接到T載體上，利用載體通用引物進行測序。
(6)基因cDNA全長的拼接。利用DNA序列分析軟件將步驟(5)中所獲得的序列與基因編碼區(qū)序列進行拼接，便可獲得基因的cDNA全長。
利用上述方法，我們可以快速獲得細菌基因cDNA全長。
表1?用于擴增細菌17β-HSD基因和dcp基因5’UTR和3’UTR引物
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