[發明專利]環介導等溫擴增禽呼腸孤病毒的引物、禽呼腸孤病毒的檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201210040492.8
• 申請日: 2012-02-22
• 公開（公告）號: CN102586479A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 張琳;張秀美;胡北俠;楊少華;顏世敢;許傳田
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

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技術領域????

本發明涉及禽呼腸孤病毒檢測技術領域，特別涉及環介導等溫擴增禽呼腸孤病毒的引物，還涉及一種禽呼腸孤病毒的檢測試劑盒，還涉及所述禽呼腸孤病毒的檢測方法。

背景技術???

禽呼腸孤病毒（Avian?reoviruses，ARV）屬呼腸病毒科正呼腸孤病毒屬，主要感染雞、火雞、鴨、鵝等多種禽類。禽呼腸孤病毒主要引起禽類關節炎、腱鞘炎,?同時也會引發生長遲緩、心包炎、心肌炎、肝炎、骨質疏松以及急性和慢性呼吸道疾病等。此外,?禽呼腸孤病毒與其他免疫抑制性疾病的混合感染在雞群中普遍存在,?導致雞生長緩慢、飼料報酬率低，影響免疫效果,?給養禽業造成巨大的經濟損失。

目前，禽呼腸孤病毒診斷方法有很多,?主要有免疫瓊脂擴散（AGP）試驗、酶聯免疫吸附(ELISA)試驗、免疫印跡（IBT）、聚合酶鏈式反應(PCR)以及實時熒光定量(real-time?PCR)等。但上述方法存在試驗周期較長、操作繁瑣、受檢測材料限制、對實驗儀器及檢測人員的技術要求高等不同缺點,?因此不適合在基層實驗室應用。

董嘉文、孫敏華等在《中國獸醫學報》2011年7月第31卷第7期中發表的文章《禽呼腸孤病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立》中提到根據禽呼腸孤病毒基因序列設計了特異對應靶序列的6個基因區段的4條引物，并對此方法的反應條件進行了優化。但此文章中公開的檢測方法靈敏度低，最低檢出量為4ELD50，且使用SYBR?GreenⅠ為熒光染料，極易造成交叉污染。

發明內容???

為了解決以上LAMP方法檢測中存在的靈敏度低和容易污染的問題，本發明提供了一種檢測靈敏度高的環介導等溫擴增禽呼腸孤病毒的引物。

本發明還提供了一種能夠有效避免交叉污染禽呼腸孤病毒的檢測試劑盒。

本發明的另一個目的是提供了禽呼腸孤病毒的檢測方法。

本發明是通過以下方式實現的：

一種環介導等溫擴增(loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)禽呼腸孤病毒的引物，共包括外側引物對、內側引物對和環形引物對三對特異性引物，序列如下：

一對引物是能與禽呼腸孤病毒S1133株（GeneBank?Accession?Number?AF330703）中p10基因（序列表中序列1）結合的外側引物對：

上游引物F3：5’-?ATGCTGCGTATGCCTCCC-3’,見序列表中序列2，

下游引物B3：?5’-?CCAGCTCACGATGGAAGAC-3’,?見序列表中序列3，

一對引物是能與禽呼腸孤病毒S1133株（GeneBank?Accession?Number?AF3307030中p10基因結合的內側引物對:

上游引物FIP：

?5’-?ACGTAGCTTGCAAATCACCACCTTTTGTGTAACGGTGCGACTGCT-3’,?見序列表中序列4，

下游引物BIP：

5’-?CATAATTGCATATTGGCCTTATCTTTTTTACGTGCAGCGTCCGCCTT-3’,?見序列表中序列5，

一對引物是能與禽呼腸孤病毒S1133株(9GeneBank?Accession?Number?AF3307030)中p10基因結合的環形引物對:

上游引物LF：5’-?GCCTGACAATGAACGTTACC-3’,?見序列表中序列6，

下游引物LB：?5’-?AGCGGCGGGTGGTGGTTTC-3’，?見序列表中序列7，

外側引物對、內側引物對、環形引物對的摩爾比為1:8:4。

引物識別的八個區域是匹配近年所有禽類呼腸孤病毒p10基因的保守區，所以引物能夠識別所有的禽類呼腸孤病毒p10基因，所述的外側引物對、內側引物對和環形引物對作為一個整體使用，使用時應盡量避免引物二聚體的形成。

一種禽傳染性支氣管炎病毒的檢測試劑盒，包括環介導等溫擴增反應液，環介導等溫擴增反應液中含有上述三對特異性引物。

所述的檢測試劑盒，每24μL環介導等溫擴增反應液中含有外側引物對上游引物和下游引物各5pmol，內側引物對上游引物和下游引物各40pmol，環形引物對上游引物和下游引物各20pmol。