[發明專利]核酸分子在固態納米孔中的減速方法

有效

• 申請號: 201210039855.6
• 申請日: 2012-02-20
• 公開（公告）號: CN102590314A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 魯鉑;趙清;俞大鵬
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: G01N27/403
• 分類號: G01N27/403
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種核酸分子在固態納米孔中的減速方法。

背景技術

基于固態納米孔器件的DNA單分子探測分析被認為是最有希望實現第三代快速低成本人類基因測序(在24小時內花費1000美元以下實現單個人的基因組測序)的技術路線之一，成為目前研究和應用探索的熱點，除哈佛大學、波士頓大學、布朗大學、加州理工學院、荷蘭代爾夫特工業大學等研究小組外，IBM公司也在2009年10月宣布加入下一代人類基因組測序-1000美元計劃，以基于納米孔器件的測序技術為實現方法，使納米孔的研究由基礎研究開始走向應用(D.Branton，et?al.Nature?Biotechnology26(10)，1146(2008)；M.Zwolak?and?M.Di?Ventra，Reviews?of?Modern?Physics?80(1)，141(2008).)。納米孔是指納米薄膜上直徑5-10納米的介孔。在電解溶液中通過電泳驅動生物分子如DNA穿過納米孔以實現基于納米孔器件的單分子探測和分析能力。在納米孔的有限空間里可以通過各種手段對大量分子進行快速的分析，當高聚物分子穿過納米孔時，高聚物分子的結構信息和探測的信號特征有一一對應關系。利用該特性可以直接對數千堿基對長度的單鏈DNA分子進行表征，避免了擴增或標記實驗準備環節，使得快速低成本DNA測序技術成為可能。目前阻礙這一技術長足發展的最大困難在于在電場驅動電壓下，DNA穿孔速度過快，超出了通用儀器的分辨率，從而無法實現對單堿基的差別識別。

目前國際上較為常用的實驗技術是在納米孔兩端加一個電壓，通過電場驅動，使DNA分子從孔一端電泳通過納米孔，在外電路收集的離子電流會出現一個突然下降，電流的突然下降值和阻滯時間，可以對應DNA的生物學信息。但是單純使用電場調節，DNA的穿孔速度太快，基本在一個堿基一微秒的量級，而目前儀器的最小分辨率為4微秒，也就是說，如果想要區別不同堿基之間的差別，通過現有手段，時間分辨率是無法達到的。要提高時間分辨率，就必須使DNA分子的穿孔時間延長，有效減慢DNA在孔中的運動速度。美國Boston?College的Amit?Meller等人通過改變Cis和Trans腔填充的溶液鹽濃度，可以在5nm的SiN納米孔中，實現DNA分子毫秒量級的穿孔過程(M.Wanunu，W.Morrison，Y.Rabin，A.Y.Grosberg?and?A.Meller，Nature?Nanotechnology，5，160，(2010))。但是他們對產生這種現象的機理解釋不清楚，而且他們使用的納米孔很小，DNA與納米孔壁之間的相互作用可能會起作用，而這對實驗的可控性大打折扣。而且直徑很小的納米孔在實驗實現起來非常困難，成功率很低。美國哈佛大學的Mark等人通過快速改變電場方向的方法，可以使通過納米孔的DNA分子再次被捕捉，重新返回并再次穿過納米孔，實現部分的控制DNA在孔中和孔附近的運動(M.Gershow，J.A.Golovchenko，Nature?Nanotechnology，2，775(2007))。但是這種方法實驗條件繁瑣，成功率很低，可控性不好，很難實現真正意義上的實用價值。美國阿肯色大學的Jiali?Li等通過在溶液中加入甘油，可以增加DNA的穿孔時間，但是實驗條件要求非?？量?，對實驗技術要求很高(D.Fologea，J.Uplinger，B.Thomas，D.S.McNabb，and?J.L.Li，Nano?Letters?5，1734(2005))。而且隨著甘油的增加，導致溶液粘滯系數增加，DNA穿孔阻滯電流值幅度下降，這樣測試的信噪比下降，導致測量誤差增大。另外可以通過降低電壓，使DNA穿孔速度減慢，但是電壓降低導致電流信號降低，信噪比變差，導致測量非常困難。

發明內容

本發明的目的是提供一種納米孔測序法中降低核酸分子穿孔速度的方法。

本發明所提供的降低核酸分子穿孔速度的方法，是基于現有的固態納米孔測序法，包括下述步驟：將待測的核酸分子加入到盛有電解液的納米孔測序裝置中，所述納米孔測序裝置包括：設有正極和負極的電解池、以及分隔所述電解池正極和負極的固態納米孔薄膜，所述待測的核酸分子置于所述電解池的負極腔室，測定時在正極和負極間施加電壓；其改進在于：測定時同時引入一個壓強外場作為電場的反向外場，從而實現核酸分子的穿孔減速。

本發明中所述核酸分子包括雙鏈或單鏈DNA、RNA以及肽核酸。

所引入的壓強外場產生的壓強可為0.5-2.5個標準大氣壓。