[發明專利]一種多糖和蛋白的偶聯物

無效

• 申請號: 201210039757.2
• 申請日: 2012-02-20
• 公開（公告）號: CN102580073A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 曹誠;王遠;靳彥文;劉萱
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: A61K39/106
• 分類號: A61K39/106;A61P31/04
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種多糖和蛋白的偶聯物。

背景技術

霍亂是一種烈性腸道傳染病，由革蘭氏陰性霍亂弧菌引起。人類是霍亂弧菌的天然宿主，通過食入被霍亂弧菌污染的水或食物而感染。在感染人群中病死率可在20％以上，全球每年約有12萬人死于霍亂。它的流行特點是爆發式，歷史上爆發過7次霍亂大流行。開始在數個不同地點同時發生，然后迅速傳播流行可累及許多國家并持續多年，尤其在非洲、亞洲和拉丁美洲等一些發展中國家較為嚴重。而控制它的有效途徑之一就是免疫預防接種，因此尋求研制一種適用于各種人群的有效的霍亂疫苗極其重要。

目前致病的霍亂弧菌有01和0139血清型兩種。這兩種血清型的霍亂弧菌均產生霍亂毒素(CT)，并且其蛋白質分子組成和致病機制均一致。但是，在菌體表面抗原、脂多糖構成、0抗原成分和表層結構有無莢膜等方面，這兩種血清型有所不同。目前已有分別針對01和0139霍亂的重組霍亂毒素B亞單位/全菌體(rBS-WC)疫苗和減毒活疫苗。雖然rBS-WC苗具有較好的安全性和穩定性，但存在需給以2次服菌并且對小于2歲的兒童保護力弱的缺點。而減毒活疫苗最大的特點是僅需口服1次，但存在著致腹瀉副反應以及潛在的通過基因突變重新獲得霍亂毒素與其它毒力基因的可能的弱點。并且研究認為，霍亂保護性免疫主要是由腸道粘膜局部產生和分泌到腸粘膜表面的sIgA抗體介導的，這些抗體通過抑制細菌的定居和繁殖、封閉腸毒素的活性而起保護作用。

已證實霍亂弧菌細胞壁上的脂多糖(LPS)即菌體抗原(0抗原)既是毒力因子又是重要的保護性抗原，能誘導機體產生殺弧菌抗體。但是LPS分子量較小，免疫原性弱，且再次免疫后不能產生免疫加強效應。而CTB是霍亂毒素無毒的B亞單位部分，具有良好的免疫原性，能產生重要的抗毒抗體。并且已經證實CTB是一種很好的粘膜佐劑，能夠誘導機體產生粘膜免疫反應。

因此，利用LPS和CTB研制新霍亂疫苗成為一個新的研究方向。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種多糖和蛋白的偶聯物。

本發明提供的多糖和蛋白的偶聯物，名稱為LPS-CTB，是由霍亂弧菌脂多糖和霍亂毒素無毒亞單位蛋白偶聯而成。

上述偶聯物中，所述霍亂弧菌脂多糖來自霍亂弧菌0139。

上述偶聯物中，所述霍亂弧菌脂多糖具有如下至少一種的特征：

1)所述霍亂弧菌脂多糖中蛋白含量不大于2％(質量百分含量)；

2)所述霍亂弧菌脂多糖的核酸含量不大于5％(質量百分含量)；

3)所述霍亂弧菌脂多糖的單體分子量為8Kd。

上述偶聯物中，所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的氨基酸序列為序列表中序列1。

上述偶聯物中所述霍亂弧菌脂多糖和所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的偶聯比為5-40，所述霍亂弧菌脂多糖和所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的偶聯比具體為7.636、10.833、26.034或20.300。

上述偶聯物中的霍亂弧菌脂多糖采用苯酚法提取，所述苯酚法提取包括如下步驟：

1)將所述霍亂弧菌0139用苯酚水溶液萃取，離心取有機相；

2)先將步驟1)得到的有機相加入無水乙醇至乙醇終濃度為70％、然后依次進行靜置、離心取沉淀、沉淀溶于PH值為7.6的2mM?MgSO₄-50mM?Tris緩沖液、消化，得到消化后產物；

3)將步驟2)得到的消化后產物依次進行透析、透析后溶液一次離心取上清、上清液再次離心收集沉淀，得到霍亂弧菌脂多糖。

上述苯酚法提取的提取方法中，步驟1)中，所述苯酚水溶液為體積百分含量為95％的苯酚水溶液；

所述萃取溫度為65℃-68℃，所述萃取時間為25min-35min，

所述萃取溫度具體為68℃，所述萃取時間具體為30min，

所述離心的離心力為7000g-7500g，所述離心的時間為0.8小時-1.2小時，所述離心的溫度為0℃-10℃；

所述離心的離心力具體為7300g，所述離心的時間具體為1小時，所述離心的溫度具體為10℃；

步驟2)中，所述靜置的溫度為0℃-4℃，所述靜置的時間為8小時-12小時，所述靜置的溫度具體為4℃，所述靜置的時間具體為12小時；

所述離心的離心力為7000g-7500g，所述離心的時間為0.8小時-1.2小時，所述離心的溫度為0℃-10℃；