[發明專利]一種黑松體細胞胚胎發生和植株再生方法

無效

• 申請號: 201210039667.3
• 申請日: 2012-02-21
• 公開（公告）號: CN102577956A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 葉建仁;李清清;朱麗華;吳小芹
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

1.一種黑松體細胞胚胎發生和植株再生方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）在誘導培養基上，溫度23℃，暗培養，直至將無菌的未成熟黑松合子胚誘導出胚性愈傷組織，誘導培養基采用DCR基本培養基，在其中添加1~4?mg/L?2,4-D、0.5~2?mg/L?6-BA、30g/L麥芽糖、1g/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/L?MES和6g/L瓊脂粉；

（2）采用DCR基本培養基，在其中附加2mg/L?2,4-D、1mg/L?6-BA、15g/L麥芽糖，1g/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/L?MES和6g/L瓊脂粉，對胚性愈傷組織進行維持與增殖，溫度23℃，暗培養，每2~3周繼代一次；

（3）先采用DCR基本培養基，在其中附加1.2g/L活性炭、15g/L麥芽糖、1g/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/L?MES和6g/L瓊脂粉，23℃，暗培養7~10d，對步驟（2）的胚性愈傷組織進行預處理；再采用DCR基本培養基，在其中附加10~30mg/L脫落酸、0~50g/L?聚乙二醇（6000）、60g/L麥芽糖、250mg/L?MES、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、8g/L肌醇、8g/L瓊脂粉和2g/L?AC，溫度23℃，暗培養65~75d，對預處理后的胚性愈傷組織進行體細胞胚的成熟培養；

（4）先采用DCR基本培養基，在其中附加2g/L?AC、8g/L瓊脂粉和20g/L麥芽糖，溫度23℃，先暗培養5~7d，再光照度2000lx及16/8小時的光/暗培養13~15d，對步驟（3）的成熟體細胞胚進行萌發；然后采用WPM基本培養基，在其中附加1.0mg/L?IBA、0.2mg/L?NAA、15g/L蔗糖、0.1g/L肌醇和6g/L瓊脂粉，溫度23℃，光照度2000lx及16/8小時的光/暗培養1個月，進行體細胞胚植株再生；

（5）采用WPM基本培養基，在其中附加珍珠巖、0.1g/L肌醇和15g/L蔗糖，溫度23℃，光照度2000lx及16/8h的光/暗培養，對再生植株進行壯苗1個月以上；

（6）采用體積比為1：1：1珍珠巖、土和河沙為基質，對再生植株進行移栽。

2.根據權利要求1所述的黑松體細胞胚胎發生和植株再生方法，其特征在于：步驟（1）中，無菌的黑松未成熟合子胚制備方法為：將黑松球果的珠鱗剝離后取出種子，放入滅菌的小三角瓶中，在超凈工作臺上用無菌紗布包好，先用75%乙醇表面消毒30s，再用0.1%升汞滅菌4min，無菌水沖洗4次后用無菌濾紙吸去紗布表面的水分，最后用兩把鑷子剝取雌配子體，水平放置于誘導培養基上。

3.根據權利要求1所述的黑松體細胞胚胎發生和植株再生方法，其特征在于：步驟（1）中，誘導培養時間為7~9周。

4.根據權利要求1所述的黑松體細胞胚胎發生和植株再生方法，其特征在于：步驟（1）中，胚性愈傷組織誘導的最佳配方為：DCR培養基＋4mg/L?2,4-D＋2mg/L6-BA＋30g/L麥芽糖。

5.根據權利要求1所述的黑松體細胞胚胎發生和植株再生方法，其特征在于：步驟（2）中，胚性愈傷組織穩定增殖繼代次數：繼代5次及以上。

6.根據權利要求1所述的黑松體細胞胚胎發生和植株再生方法，其特征在于：步驟（3）中，對胚性愈傷組織進行體細胞胚成熟培養的最佳配方為：DCR培養基＋30mg/L?ABA＋25g/LPEG＋60g/L麥芽糖。

7.根據權利要求1所述的黑松體細胞胚胎發生和植株再生方法，其特征在于：步驟（6）中，移栽的再生植株的根長不小于2cm。