[發明專利]水稻缺氮后恢復供氮特異性誘導表達的啟動子Y2及應用

無效

• 申請號: 201210039585.9
• 申請日: 2012-02-21
• 公開（公告）號: CN103255140A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 練興明;楊猛;張星
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術領域

本發明涉及植物基因工程技術領域。具體涉及一種水稻缺氮后恢復供氮特異性誘導表達的啟動子Y2及應用

背景技術

目前轉基因研究主要以組成型啟動子驅動目的基因表達，最典型的是花椰菜花葉病毒中分離的CaMV35S啟動子(Hirt?et?al.，1990；Battraw?et?al.，1990)，以及近年來一些植物來源的啟動子，如從水稻中克隆的肌動蛋白基因Actinl的啟動子和玉米中克隆的泛素基因ubiquitin啟動子(Schledzewski?et?al.，1994)。但是外源基因的組成型表達往往會造成資源的非必要浪費，同時大量異源蛋白的積累也會打破植物原有的代謝平衡，阻礙植物的正常生長(聶麗娜等，2008；Rai?et?al.，2009)。Kasuga等(1999)在研究中發現，使用強的組成型表達啟動子CaMV35S啟動DREB1A的表達時，對植物的生長可能起到某種程度的阻礙作用，而用誘導型的啟動子可以減輕這種狀況。誘導型的啟動子可以快速有效地誘導轉錄基因的“開、關”：可根據需要在植物特定發育階段、組織器官或生長環境下接受誘導信號，誘導基因表達，也可以隨時解除脅迫，停止表達(李杰等，2006)。因此，獲得水稻在氮饑餓狀態下誘導表達的啟動子，不僅可以減少外源基因大量表達帶來的負面影響，更能為基因工程改良水稻提供安全有效的調控。

在植物生長所需的各種大量元素中，氮素是限制植物生長和形成植物產量的首要因素。氮不僅是遺傳物質的基礎，更是蛋白質、核酸、葉綠素、酶、維生素、生物堿和植物激素等的重要組成部分(陸景陵，1994)。近半個世紀以來，世界各國都把增施氮肥作為增加水稻產量的重要農業措施，特別是第一次綠色革命之后，隨著高產耐肥品種推廣應用，農田氮肥施用量迅猛增長，極大提高了水稻的產量(鐘代斌等，2001)。農田氮肥的過量施用，隨之而來的便是氮素利用率降低以及一系列的環境問題。氮素的大量流失直接導致地下水污染和江河湖泊的富營養化作用(王光火等，2003)。

隨著分子生物學和基因工程在植物領域的迅速發展，植物對氮吸收轉運的分子機制也越來越清晰。大量的銨鹽轉運子、硝酸鹽轉運子被發現，GS/GOGAT(谷氨酸胺合成酶/谷氨酸合成酶)循環同化銨機理被揭示，為基因工程改良水稻氮的吸收利用提供大量的研究素材。雖然通過突變體或者吸收實驗等驗證了不少基因的吸收轉運功能，但是這些基因在水稻體內的超量表達并未達到提高吸收轉運銨的目的。Mohammad等(2006)用玉米ubiquitin啟動子超量表達水稻中的銨鹽轉運子OsAMT1-1，提高了水稻中銨的吸收能力以及根中總銨含量，但同時產生了銨的毒害，導致地上部生物量大量減少。如果改為缺氮誘導啟動子驅動，就有可能根據植株的需要，適當控制銨的吸收，避免毒害。GS是參與NH4⁺同化合成谷氨酰胺(Gln)的主要酶，Cai等(2009)用35S啟動子在水稻品種中花11中超量表達水稻谷氨酰胺合成酶基因GS1；1、GS1；2和大腸桿菌谷氨酰胺合成酶基因glnA，GS活性、總氮含量、氨基酸含量、可溶性蛋白等都得到了顯著提高，但是單株生物學產量及籽粒產量都顯著下降了。如果改為供氮誘導啟動子驅動，不僅可以降低組成型表達造成的“浪費”，更可以保證僅在供氮充足的情況下促進GS的同化，避免單株因氮源不足而造成生物學產量降低。

本發明通過芯片發掘了一個供氮誘導基因表達的啟動子，用實時定量realtime?PCR在三個不同品種中進行了驗證，同時通過水稻穩定轉化進一步確定了該啟動子是一個供氮誘導的啟動子，為基因工程改良水稻對氮的吸收利用提供了新的材料。

發明內容

本發明的目的在于克服現有的技術缺陷，提供了一種在水稻中供氮誘導基因表達啟動子的應用。啟動子Y2在水稻中供氮誘導基因表達的用途如下：芯片結果顯示，日本晴和珍汕97在缺氮脅迫7d后再供氮時，啟動子Y2控制的下游基因在根中均誘導表達25倍左右，而在地上部組織中不誘導表達。在第三個品種中花11中，通過realtime?PCR驗證(Realtime?PCR的方法參見TAKARA商業試劑盒的使用說明書，貨號：code：DRR041A)發現啟動子Y2控制的下游基因在缺氮7d后再供氮2h時即可誘導30倍以上，供氮6h誘導可達40倍以上。從中花11(或稱ZH11)材料中擴增啟動子Y2全長序列融合GUS基因穩定轉化水稻，并構建系列5`端缺失載體，將轉基因陽性材料進行缺氮脅迫后供氮處理，發現供氮前后GUS基因在根中表達量顯著誘導表達，而GUS蛋白活性相比誘導前明顯上升。進一步驗證了啟動子Y2供氮誘導表達的特性，并且功能區段在ATG上游519bp。