[發明專利]一種鑒別牛羊肉真假的LAMP檢測方法

有效

• 申請號: 201210039517.2
• 申請日: 2012-02-21
• 公開（公告）號: CN102586436A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 萬發春;劉桂芬;劉曉牧;成海建;譚秀文;宋恩亮
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 韓百翠

技術領域

本發明涉及涉及利用LAMP技術鑒別牛羊肉的真假，屬于分子遺傳學領域。

背景技術

目前，國內牛肉價格的飛速上漲和短缺導致國外的牛肉大量通過走私等途徑進入中國，同時，國內也出現了很多不和諧的現象，2011年4月份安徽首次曝光了利用牛肉膏等添加劑使豬肉變牛肉的事件，此后，在全國多個省市均發現了類似的產品。一時間，人們對牛肉等食品安全的關注成為了全社會的焦點。其實，牛肉市場面臨的豬肉變牛肉事件僅是冰山的一角。在社會上還大量存在著用雞肉、鴨肉等低價肉甚至是一些病死肉加工冒充牛肉的現象。面對目前牛羊肉市場存在的亂象，人們只能從色澤、氣味、彈性等多個方面進行初步鑒別，但大多數消費者都不可能掌握這種專業知識，很難對生牛肉進行鑒別，對加工后的牛肉則更是難以鑒別。目前社會上缺乏牛羊肉的準確鑒別技術。通過現代化的DNA鑒定技術，可以進行鑒別。早在2008年新華每日電訊就報道過杭州一個市民買10元牛肉花2800元進行DNA鑒定的事件，2010年中新網報道了寧波一個消費者花1800元通過DNA親子鑒定技術鑒別牛肉真假的事件，表明這種方法雖然能夠鑒別，但所需時間長，費用高。因此，迫切需要建立一種簡單、廉價的牛羊肉鑒別方法，以維護牛羊肉市場的安全，保護廣大消費者的身體健康。

線粒體基因組具有種內高度保守的特性，在肉制品和飼料的鑒別中越來越被受到重視。近年來，基于線粒體基因的鑒定方法不斷出現，包括PCR-RFLP、多重PCR、熒光定量PCR等，這些方法都需要涉及到PCR、熒光定量PCR等昂貴儀器。

發明內容

本發明的目的是針對國內外已有方法在檢測技術上存在的缺點，在檢測技術上加以改進。環介導等溫擴增技術(LAMP)是由日本學者Notomi?T等(2000)設計創立的，這種新型核酸擴增技術具有靈敏度高、反應迅速，特異性強等優點。本發明利用LAMP技術和動物線粒體DNA相結合對牛羊肉進行鑒定，整個反應可在恒溫狀態下在1h之內就可完成，而且可以通過肉眼觀察到反應結果。

本發明的技術方案是：一種鑒別牛羊肉真假的LAMP檢測方法，

(1)從GenBank中檢索獲得牛種屬特異性的保守序列，并進行軟件比對分析，確定序列的準確性；

(2)根據步驟(1)的序列設計多組引物，每組引物包括一對外引物F3/B3和一對內引物FIP/BIP，引物設計通過登陸Eiken?Chemical公司的在線軟件PrimerExplore(http://www.primerexplorer.jp/e/)進行；利用LAMP實時濁度儀對設計引物進行特異性篩選，確定高度特異性的引物；

(3)配置23μL?LAMP反應液，構建成檢測體系；所述23μL?LAMP反應液含有12.5μL?2×等溫反應緩沖液、1μL?5μM?Primer?F3、1μL?5μM?Primer?B3、2μL20μM?Primer?FIP、2μL?20μM?Primer?BIP、1μL?Bst?DNA聚合酶、3.5μL水；其中：2×等溫反應緩沖液含有40mM的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽Tris-HCl(pH8.8)、20mM的氯化鉀、16mM的硫酸鎂、20mM的硫酸銨、20％的Tween20、1.6M甜菜堿、2.8mM?dNTP。

(4)按常規方法提取基因組DNA，取1μL提取的基因組DNA和1μL的熒光檢測試劑(Fluorescent?Detection?Reagent，FDR)加入LAMP反應液中，使終反應體積為25μL，10000rpm瞬時離心30秒混勻反應液；

(5)置60℃恒溫水浴中進行LAMP擴增；

(6)根據反應液顏色進行陰陽性判斷，若反應液變成綠色，說明待測樣品存在牛羊肉；若為桔黃色，則待測樣品不存在牛羊肉。

本發明的優點是提供了一種利用LAMP技術，準確、廉價鑒別牛羊肉真假的標準方法。本方法具有眾多優點，一是模板和引物制備簡單，容易操作；二是具有高度的特異性，準確性高達100％；三是具有高度的靈敏度，比普通PCR更為靈敏，僅需極少量的樣品即可(小于1克)；四是結果判定方便，通過肉眼觀察即可。但本方法暫時無法區分牛肉和羊肉。

本發明可用于任何具備相應儀器設備的部門進行牛羊肉的真假鑒別，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。

附圖說明

圖1為5組LAMP引物進行特異性篩選圖。圖1中引物自左向右順序依次為：陽性對照、陰性對照、引物1、引物2、引物3、引物4、引物5。