[發(fā)明專利]一種芽孢桿菌及采用該菌種生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210039111.4
• 申請(qǐng)日: 2012-02-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102559559A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭學(xué)平;劉愛(ài)華;欒貽宏;石艷麗;李海娜;薛蔚
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N9/42;C12R1/07
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 李桂存

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌及用該芽孢桿菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的方法，屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

透明質(zhì)酸酶是能夠降解透明質(zhì)酸的一類酶，Karl?Meyer根據(jù)透明質(zhì)酸酶的作用機(jī)制，將透明質(zhì)酸酶分為三類：（1）內(nèi)切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶為水解酶，作用于β-1,4糖苷鍵，終產(chǎn)物主要為四糖，也可作用于軟骨素或硫酸軟骨素，并有轉(zhuǎn)糖苷酶活性，睪丸、蜂毒以及溶酶體透明質(zhì)酸酶屬于此類。（2）水蛭、十二指腸蟲(chóng)來(lái)源的透明質(zhì)酸酶，為內(nèi)切β-葡糖苷酸酶，作用于β-1，3糖苷鍵，也是水解酶，主要降解產(chǎn)物是四糖，特異性降解透明質(zhì)酸。（3）細(xì)菌透明質(zhì)酸酶，也稱透明質(zhì)酸裂解酶，作用于β-1，4糖苷鍵。

目前市場(chǎng)上的透明質(zhì)酸酶主要是動(dòng)物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶，用于人體暫時(shí)降低細(xì)胞間質(zhì)的粘性，可促使皮下輸液、局部積貯的滲出液或血液加快擴(kuò)散而利于吸收，為一種重要的藥物擴(kuò)散劑。臨床用作藥物滲透劑，促進(jìn)藥物的吸收，促進(jìn)手術(shù)及創(chuàng)傷后局部水腫或血腫消散。

由于動(dòng)物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶成本高，而且人們擔(dān)心動(dòng)物病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，多家提取法制備透明質(zhì)酸酶制劑的廠家已停止該制劑的生產(chǎn)，人們希望使用更安全價(jià)廉的透明質(zhì)酸酶。微生物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶不受來(lái)源限制，提取容易，純度高，不易產(chǎn)生免疫反應(yīng)，可以滿足人們的這種需求，因此多家研究機(jī)構(gòu)致力于研究微生物發(fā)酵法制備透明質(zhì)酸酶。自透明質(zhì)酸酶發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)多種微生物可以產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶，包括Streptococcus、Staphylococcus、Clostridium、Propionibacterium、Peptostreptococcus以及Streptomyces等，但是迄今為止，文獻(xiàn)中報(bào)道的微生物產(chǎn)的透明質(zhì)酸酶酶活均較低，較高的酶活報(bào)道出現(xiàn)在專利WO2010130810A1中，該專利中透明質(zhì)酸酶生產(chǎn)菌是鏈霉菌，最高酶活是1.3×10²IU/ml，其余文獻(xiàn)的酶活均低于100IU/ml，因此制備透明質(zhì)酸酶及酶法制備低分子透明質(zhì)酸及寡聚透明質(zhì)酸都處于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，不能用于大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有透明質(zhì)酸酶生產(chǎn)工藝少，且所得的透明質(zhì)酸酶酶活低的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)高活性透明質(zhì)酸酶的菌種——芽孢桿菌（Bacillus）A50。

本發(fā)明還提供了采用該芽孢桿菌（Bacillus）A50生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的方法，以該菌種生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶，酶活高，可用于大規(guī)模生產(chǎn)，并且解決了動(dòng)物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶成本高的問(wèn)題，便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。所得的透明質(zhì)酸酶可用于降解高分子透明質(zhì)酸，生產(chǎn)低分子透明質(zhì)酸及寡聚透明質(zhì)酸，應(yīng)用前景廣闊。

本發(fā)明的芽孢桿菌（Bacillus）A50是從空氣中分離得到，因?yàn)闊o(wú)法重復(fù)得到，所以該菌種已經(jīng)在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC）進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為CGMCC?NO.?5744，保藏時(shí)間為2012年2月8日。

菌種芽孢桿菌（Bacillus）A50?CGMCC?NO.?5744的獲取過(guò)程為：將裝有富集培養(yǎng)基的平皿打開(kāi)蓋，放置于空氣中，收集空氣中沉降菌，約1小時(shí)后，蓋上蓋，置于25～40℃培養(yǎng)箱中有氧培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時(shí)后，將分離得到的單菌落接種于篩選培養(yǎng)基中，25～40℃，150rpm，有氧培養(yǎng)12～16小時(shí)，采用中國(guó)藥典方法測(cè)定透明質(zhì)酸酶活力，選擇酶活力最高的菌種作為本發(fā)明的菌種，菌種酶活力可達(dá)10⁵?IU/ml。

????上述所采用的各培養(yǎng)基組成如下：

????富集培養(yǎng)基（100ml）：蛋白胨0.2～2.0g，酵母粉0.2～2.0g，K₂HPO₄·3H₂O,MgSO₄·7H₂O?0.05～0.15g、透明質(zhì)酸鈉0.01～1g，瓊脂粉2g。

篩選培養(yǎng)基（100ml）：蛋白胨0.2～2.0g，酵母粉0.2～2.0g，K₂HPO₄·3H₂O?0.05～0.15g,MgSO₄·7H₂O?0.05～0.15g，透明質(zhì)酸鈉?0.01～1g。

篩選所得的芽孢桿菌（Bacillus）A50?CGMCC?NO.?5744具有如下的特征：

1、形態(tài)特征

???菌體桿狀，單個(gè)或鏈狀。菌落乳白色，有皺褶。