[發明專利]一種檢測一氧化氮的超高靈敏熒光探針

無效

• 申請號: 201210038636.6
• 申請日: 2012-02-21
• 公開（公告）號: CN102617467A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 肖義;于海波;張玉慧;張曉琳
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C07D221/14
• 分類號: C07D221/14;C07F9/50;C09K11/06;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 大連理工大學專利中心 21200
• 代理人: 梅洪玉

技術領域

本發明涉及一類檢測一氧化氮的高靈敏度萘酰亞胺類熒光探針。?

背景技術

一氧化氮在生命科學中扮演重要角色，是一個重要的信使分子。自20世紀80年代，科學家們發現在生物體生命活動中會產生一氧化氮分子。一氧化氮不僅具有免疫調節、神經傳遞、血壓生理調控和血小板凝聚的抑制等生理功能，而且還與很多疾病，包括基因突變、癌變、動脈硬化等疾病密切相關。然而，生物體中產生的一氧化氮其生成量較少并且半衰期較短，對其進行實時、原位、定量的檢測，將有助于我們進一步了解一氧化氮的生理功能，有助于了解某些疾病的致病原因，并最終找到合適的治療方法。?

目前對一氧化氮的檢測方法主要有電化學法、比色法、質譜法、順磁法。為了實現對生物樣品中產生的一氧化氮進行實時原位的檢測，近年來利用熒光探針的熒光檢測法表現出了獨特的優勢：熒光探針對生物體毒性低，不損傷樣品細胞，通過與常規監測儀器--熒光顯微鏡結合對一氧化氮實現原位的檢測。目前對一氧化氮進行識別的熒光團主要有熒光素、羅丹明、BODPIY、菁類染料等，其中熒光素DAF-2系列和羅丹明DAR-2系列是目前主要商品化(InvitrogenTM)的一氧化氮檢測熒光探針，然而其合成制備工藝比較繁瑣，致使其成本較高，價格昂貴，不利于廣泛推廣使用。?

目前盡管對生命體中一氧化氮的產生和作用機理進行了相應的研究探索，然而，由于一氧化氮的產生量較少、壽命較短，并且僅僅在特定的細胞器中產生。對其進行原位的檢測能更好的了解一氧化氮在生命活動中的作用，以及其作為信使分子對生物大分子的調控作用，因此急需設計低成本、高靈敏度的一氧化氮熒光探針。尤其是近年來熒光成像顯微技術的發展，而基于萘酰亞胺熒光發色團的一氧化氮熒光探針卻很少，并且在國際上尚未報道。為了方便對一氧化氮的實時原位的檢測，急需研究、開發具有實用性的高靈敏度一氧化氮探針。?

發明內容

本發明提供了一類檢測一氧化氮的萘酰亞胺類熒光探針。其結構通式如(I)所示：?

本發明的目的之二是提供如下的方法來實現：?

該萘酰亞胺類熒光探針的合成方法按如下步驟進行：?

a、以等摩爾量的4-溴-1，8-萘酐與鄰硝基對苯二胺為原料，溶解于乙二醇單甲醚中，加熱至120℃，反應5小時后將反應液倒入水中，抽濾，減壓干燥，得到淡黃色固體。?

b、將a步驟所得到的淡黃色固體溶于無水DMSO(二甲基亞砜)中，加入淡黃色固體等摩爾量的取代的伯胺，加熱回流5小時，將反應液倒入水中，抽濾，減壓干燥，得到黃色固體。伯胺可以是丙、丁胺、二甘醇胺、2-(N-甲基)哌嗪乙胺、2-嗎啉乙胺、2-氨基乙基三苯基磷或3-氨丙基三苯基磷。?

c、將b步驟所得到的黃色固體溶于四氫呋喃和甲醇的混合液中，在2.5MPa的氫氣和催化劑催化下，室溫攪拌24小時，得到熒光探針產品。四氫呋喃∶甲醇＝5∶1，催化劑為Pd/C、雷尼鎳、Fe/HCl或氯化亞錫。?

上述萘酰亞胺類熒光探針的制備反應式如下：?

本發明的萘酰亞胺熒光探針用于化學模擬生物體系中檢測一氧化氮分子，以及活細胞和組織切片中的一氧化氮的分析檢測和熒光成像分析。活細胞為Hella細胞株、MCF-7細胞株、RAW264.7細胞株等。?

本發明的萘酰亞胺熒光探針具有的特征如下：?

該探針的激發波長在400-460nm范圍內，對溶劑極性不敏感，化學穩定性好；探針分子對一氧化氮具有較高的選擇性，其他活性分子如H₂O₂、單線態氧、過氧亞硝酸根等對其無干擾，并且還具有較高的靈敏度，其靈敏度在0.5-2nmol范圍；通過選用不同類型的伯胺，以便調節探針的溶解性和pH，以改善其溶解性和細胞滲透性，該熒光探針對細胞本身以及生物?體無毒副作用，適用于細胞和生物組織中一氧化氮的檢測。?

本發明的重要貢獻在于合成了一系列檢測原生性一氧化氮的萘酰亞胺類熒光探針，其具有較長的發射波長(530nm)可以避免細胞或組織的自發熒光的干擾，提高成像深度，減少對生物組織的光損傷；本發明中探針的設計機理是基于光誘導的電子轉移機理，并且合理的調節基團，實現了高選擇性、高靈敏度的檢測細胞中原生的一氧化氮；通過細胞成像實驗，成功的觀測到線粒體和溶酶體中均存在一氧化氮，這為一氧化氮的病理學研究提供了直觀而又簡捷的生物檢測試劑。?

附圖說明

圖1是本發明中熒光探針(實施例5)對pH的響應圖。?