[發明專利]高靈敏度實時熒光檢測方法

有效

• 申請號: 201210038303.3
• 申請日: 2012-02-20
• 公開（公告）號: CN102534033A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 張文艷;陳悅科;劉明霞
• 申請（專利權）人: 蘇州華益美生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京萬科園知識產權代理有限責任公司 11230
• 代理人: 張亞軍

1.檢測樣品中靶核酸的方法，其包括：

(1)將樣品與PCR擴增試劑和熒光標記的探針混合，其中探針的核酸部分包括第一互補序列、靶核酸特異性序列、第二互補序列和延伸序列，而且第一互補序列和第二互補序列能夠互補配對，優選探針的核酸部分從5’端到3’端依次由第一互補序列、靶核酸特異性序列、第二互補序列和延伸序列組成；和

(2)進行PCR，并實時檢測熒光。

2.權利要求1所述的方法，其中靶核酸是RNA或DNA，優選是HCV?RNA或HBVDNA，例如HBV?S基因或HCVNS2基因。

3.權利要求1所述的方法，其中PCR擴增試劑包括能擴增靶核酸序列的引物對、DNA聚合酶和dNTP。

4.權利要求1或3所述的方法，其中PCR是RT-PCR；優選其中PCR擴增試劑還包括反轉錄酶，優選還包括RNase抑制劑。

5.權利要求3所述的方法，其中引物對是CGAGGCAGGTCCCCTAGAA和CGGCGATTGAGACCTTCGT，或者是TCGCCATATTACAAGCGCTACA和GCGCTTCTACTCTGGTCAGAAAA。

6.權利要求1所述的方法，其中，

靶核酸特異性序列為8～20個堿基的長度，優選為9～15個堿基的長度，更優選為10～12個堿基的長度，最優選為TCCCTCGCCTCG或GGTGGCTTCA；

第一互補序列分別為4～8個堿基的長度，優選為5～7個堿基的長度，更優選為5個堿基的長度，最優選為AGAAC或CATGT；

第二互補序列分別為4～8個堿基的長度，優選為5～7個堿基的長度，更優選為5個堿基的長度，最優選為GTTCT或ACATG；和/或，

延伸序列為2～5個堿基的長度，優選為2～3個堿基的長度，更優選為2個堿基的長度，最優選為AT。

7.權利要求1所述的方法，其中PCR沒有延伸步驟，優選PCR的退火溫度為55～65℃，更優選為58～63℃，最優選為60℃；和/或，優選PCR的退火時間為20～60秒，更優選為25～40秒，最優選為30秒。

8.樣品中靶核酸的檢測試劑盒，其包括PCR擴增試劑和熒光標記的探針，其中探針的核酸部分包括第一互補序列、靶核酸特異性序列、第二互補序列和延伸序列，而且第一互補序列和第二互補序列能夠互補配對，優選探針的核酸部分從5’端到3’端依次由第一互補序列、靶核酸特異性序列、第二互補序列和延伸序列組成。

9.權利要求8所述的試劑盒，其中PCR擴增試劑包括能擴增靶核酸序列的引物對、DNA聚合酶和dNTP。

10.權利要求8所述的試劑盒，其中PCR擴增試劑是RT-PCR擴增試劑，其包括能擴增靶核酸序列的引物對、DNA聚合酶、dNTP和反轉錄酶，優選還包括RNase抑制劑。

11.權利要求9或10所述的試劑盒，其中引物對是CGAGGCAGGTCCCCTAGAA和CGGCGATTGAGACCTTCGT，或者是TCGCCATATTACAAGCGCTACA和GCGCTTCTACTCTGGTCAGAAAA。

12.權利要求8所述的試劑盒，其中

靶核酸特異性序列為8～20個堿基的長度，優選為9～15個堿基的長度，更優選為10～12個堿基的長度，最優選為TCCCTCGCCTCG或GGTGGCTTCA；

第一互補序列分別為4～8個堿基的長度，優選為5～7個堿基的長度，更優選為5個堿基的長度，最優選為AGAAC或CATGT；

第二互補序列分別為4～8個堿基的長度，優選為5～7個堿基的長度，更優選為5個堿基的長度，最優選為GTTCT或ACATG；和/或，

延伸序列為2～5個堿基的長度，優選為2～3個堿基的長度，更優選為2個堿基的長度，最優選為AT。

13.權利要求8～12所述的試劑盒在制備用于檢測樣品中靶核酸的方法的檢測產品中的應用。

14.權利要求13所述的應用，其中檢測樣品中靶核酸的方法是權利要求1～7所述的方法。

15.權利要求13所述的應用，檢測產品還包括記載權利要求1～7所述的方法的說明書和/或熒光PCR儀。

16.權利要求1～15中所用的探針或引物對。