[發(fā)明專利]可線性化穿梭載體BmBacmid的構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210037290.8
• 申請(qǐng)日: 2012-02-17
• 公開（公告）號(hào): CN102559760A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳健;陳琴;張耀洲;呂正兵;陳倩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/866
• 分類號(hào): C12N15/866;C12N7/01
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.可線性化穿梭載體BmBacmid的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步驟：

1)、構(gòu)建pBacAvrII2載體：在pBacPAK8載體上引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)FseI和AvrII；從而構(gòu)建成含兩個(gè)AvrII位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移載體pBacAvrII2；

2)、構(gòu)建含細(xì)菌人工染色體BAC的pBACAvrII2載體：

設(shè)計(jì)一對(duì)兩端含F(xiàn)seI位點(diǎn)的引物，從DH10Bac?Bacmid上擴(kuò)增細(xì)菌人工染色體BAC片段，插入到pBacAvrII2中；得到pBACAvrII2載體；

3)、家蠶桿狀病毒表達(dá)載體-----可線性化穿梭載體BmBacmid的構(gòu)建：

以pBACAvrII2載體為模板，PCR擴(kuò)增BAC的片段，所述BAC的片段含兩個(gè)AvrII和FseI酶切位點(diǎn)、且片段兩端為多角體基因側(cè)翼序列，然后將PCR產(chǎn)物和線性化的BmBacPAK共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，在家蠶細(xì)胞內(nèi)通過同源重組產(chǎn)生重組病毒，從而獲得BmBacmid載體，所述BmBacmid載體為可線性化穿梭載體BmBacmid。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可線性化穿梭載體BmBacmid的構(gòu)建方法，其特征是：

所述步驟1)為：

pBacAvrII2載體是在pBacPAK8載體的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，成功引入兩個(gè)AvrII位點(diǎn)；依次進(jìn)行以下步驟：

①、第一個(gè)AvrII位點(diǎn)的引入，構(gòu)建pBacAvrII1載體：

對(duì)轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8DNA多角體基因啟動(dòng)子3′端側(cè)翼的orf1629基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，將TTTAGG突變?yōu)镃CTAGG，為AvrII位點(diǎn)，從而在SnaBI和SwaI之間，即在orf1629基因的3′端引入第一個(gè)AvrII酶切位點(diǎn)；

②、第二個(gè)AvrII位點(diǎn)的引入，構(gòu)建pBacAvrII2載體：

在pBacAvrII1載體DNA上的EcoRV和BamHI位點(diǎn)之間引入一段DNA序列；所述序列包含F(xiàn)seI和AvrII兩個(gè)酶切位點(diǎn)，從而構(gòu)建成含兩個(gè)AvrII位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移載體pBacAvrII2。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可線性化穿梭載體BmBacmid的構(gòu)建方法，其特征是：

所述步驟3)為依次進(jìn)行以下步驟：

①、擴(kuò)增pBACAvrII2載體中BAC片段：

為了使BAC片段能與線性化BmBacPAK同源重組，故從pBACAvrII2上擴(kuò)增兩端含多角體基因側(cè)翼序列的BAC片段；以pBACAvrII2為模板，用KOD-FX?DNA聚合酶PCR擴(kuò)增合成BAC片段；

②、線性化BmBacPAK制備：

家蠶桿狀病毒BmBacPAK先經(jīng)蛋白酶K消化后通過苯酚氯仿抽提獲得病毒DNA，所述病毒BmBacPAK?DNA含有三個(gè)Bsu36I酶切位點(diǎn)，故通過Bsu36I酶切進(jìn)行線性化，得到Bsu36I線性化的BmBacPAK?DNA；

③、BmBacmid的構(gòu)建：

將上述步驟①中PCR產(chǎn)物與上述步驟②所得的Bsu36I線性化的BmBacPAK?DNA按照2∶1的分子數(shù)之比共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，待細(xì)胞完全病變后收集培養(yǎng)上清分離病毒，并提取病毒基因組DNA；

以病毒基因組DNA電轉(zhuǎn)化ElectroMAX?DH10B感受態(tài)細(xì)胞，涂含Kan、IPTG和X-gal的LB平板培養(yǎng)24h，挑取狀態(tài)良好的藍(lán)斑接種LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)48小時(shí)后提取Bacmid?DNA；將提取的Bacmid?DNA轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞病變的即為可線性化穿梭載體BmBacmid。