[發明專利]一種聾病易感基因12S rRNA 1555A>G熒光檢測試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201210033190.8
• 申請日: 2012-02-14
• 公開（公告）號: CN102660636A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 萬戈江;魏宏泉;步訊;夏子芳
• 申請（專利權）人: 北京科聆金儀生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種檢測聾病易感基因12S?rRNA?1555A＞G及Amelogenin基因座的熒光檢測試劑盒，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

世界范圍內對聽力語言殘疾者進行的致病因素研究表明，約60-80％患者的病因與遺傳因素有關，其中發達國家的臨床研究數據表明，遺傳性耳聾在耳聾患者中約占80％。因此近十幾年來，遺傳性耳聾的發病機制及其分子流行病學的研究成為了聾病研究最重要的內容之一。隨著人類基因組計劃完成，聾病基因的定位和克隆取得了巨大的進步，聾病的分子遺傳學研究和分子流行病學的數據使研究者們逐步認識到聾病易感基因突變在維護聽力健康和發現聽力異常中的重要性。

藥物的耳毒性是導致語前聽力損失的一個重要因素，部分與線粒體12S?rRNA基因1555A＞G突變有關，該突變可以增加耳蝸對氨基糖甙類藥物的敏感性。在美國，耳毒性藥物相關的聽力損失患者中，10％的具有12S?rRNA基因1555A＞G突變，美國語前聽力損失患者中，1555A＞G突變患者的發病率約為1/20000-1/40000。在西班牙，12S?rRNA基因1555A＞G突變與15-20％的家族性非綜合征型聽力損失有關，許多年老的家族成員即使沒有使用氨基糖甙類藥物也可發生因此突變導致的聽力下降。而在中國，藥物性耳聾的發病率超出了原有的想象，在一系列的文章報道中，發現在門診散發的耳聾患者中，約5％的患者是由于12S?rRNA基因1555A＞G突變導致的，而在聾啞學校這樣一個特殊群體，則高達12％的患者是由于12S?rRNA基因1555A＞G突變接觸氨基糖甙類藥物而致聾。1555A＞G突變者在出生時往往聽力正常，很難通過聽力篩查而被提前發現和預測，卻存在因耳毒性藥物的使用而發生聽力損失的隱患。

目前常用的基因檢測方法有：直接測序(direct?sequencing，DS)、連接酶檢測反應(ligase?detection?reaction，LDR)、限制性片段長度多態性分析(restriction?fragment?lengthpolymorphism，RFLP)、變性高效液相色譜分析(denaturing?high?performance?liquidchromotography，DHPLC)、定量PCR、基因芯片。這些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁瑣、結果不易判讀、重復性差、假陰性假陽性多等問題。

發明內容

本發明目的是提供一種聾病易感基因12S?rRNA?1555A＞G熒光檢測試劑盒。

為了實現上述目的，采取的技術方案：一種聾病易感基因12S?rRNA?1555A＞G熒光檢測試劑盒，該試劑盒包括擴增試劑和擴增后的基因分型用試劑；

所述擴增前試劑包括：PCR緩沖液、MgCl₂、dNTPs的混合物，Taq酶，2對引物混合物以及超純水；

所述擴增后試劑包括：用于基因分型的對應于12S?rRNA?1555A＞G檢測和Amelogenin性別鑒定基因座的等位基因標準物的混合物和內標ROX-300；

使用所述的試劑盒進行PCR復合擴增反應的條件：PCR擴增體系的pH值為8.0-9.0，鎂離子濃度為1.5-3.5mM，4種dNTP的終濃度各為200-300μM，Taq酶的用量為0.1-0.4U/μL，2對引物混合物中的單對引物終濃度為0.2-0.4μM。

使用所述試劑盒進行PCR擴增時，擴增階段反應在一個復合擴增反應體系中同時擴增12S?rRNA?1555A＞G和Amelogenin基因座。

用于12S?rRNA?1555A＞G突變檢測的引物為：SEQ?NO.1和SEQ?NO.2。

SEQ?NO.02為摻入了LNA核苷的引物(LNA核苷以黑體字表示)：

SEQ?NO.01：5’-AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3’

SEQ?NO.02：5’-GTACGCATTTATATAGAGTAGC-3’

用于Amelogenin基因座檢測的引物為：SEQ?NO.3：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’、SEQ?NO.4：5’-GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。

所述的2對引物，其中每對引物中有一條引物的5’端進行熒光染料標記，所用的熒光染料可以為相同或不同的熒光素。

所述復合擴增采用聚合酶鏈式反應來實現，采用多道或單道毛細管電泳進行檢測。