[發明專利]一種凝乳酶基因及其編碼的氨基酸序列與應用

有效

• 申請號: 201210033016.3
• 申請日: 2012-02-14
• 公開（公告）號: CN103243081B
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 成雙林
• 主分類號: C12N9/56
• 分類號: C12N9/56;C12N15/57;A23C9/12;A23C19/02
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技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種由枯草芽孢桿菌誘變株分泌的凝乳酶的基因序列及其蛋白序列與應用。

背景技術

在食品加工領域，尤其是奶酪加工領域，凝固酶是必不可少的添加劑。凝乳酶不僅可以使牛奶凝固，而且在奶酪成熟中具有不可忽視的作用(Kumar et al.，2005)。小牛皺胃凝乳酶首次被發現是一個偶然的機會，人們用動物的皮保存牛奶時，牛奶有時會出現凝固，之后小牛皺胃凝乳酶就被廣泛應用在奶酪加工領域。自從1961起，由于世界乳酪業的高速發展，使得小牛凝乳酶供應持續短缺，科學家不斷尋找能夠替代小牛皺胃凝乳酶的蛋白酶。

之后，人們發現了一些蛋白酶具有類似的凝乳效果。這些凝乳酶廣泛分布在不同的生物和組織內(Chitpinityol and Crabbe，1998)。因此，由于各類蛋白酶具有不同的理化性質、水解活性和凝乳活性，所以其用途就各不相同。人們通過向不同來源的奶液(奶牛，牦牛，山羊以及駱駝)中添加凝乳酶，并采用不同的加工手段，最終獲得口味各異的奶酪。

青藏高原(Qinghai-Tibet Plateau)是世界海拔最高的高原，氣候環境惡劣，因此其擁有許多獨特的生物質資源。牦牛，就是其中最典型的一種(Zi，2003)。牦牛常年以豐富的、無污染的草料為食，因此可以為當地居民提供大量的潔凈的食物(牦牛乳，肉，酥油)。藏民們通常會將牦牛乳加工成各種乳制品，牦牛奶酪就是其中最主要且最常見的一種。牦牛乳在總蛋白含量，脂肪含量，酪蛋白組成方面與牛奶具有明顯的差異(Brunner，1981；Li et al.，2010)，尤其特別的是牦牛乳中含有大量的β-casein，使傳統凝乳酶的凝乳速度大大降低；其次，在牦牛乳奶液的pH通常在6.0-8.0之間，而傳統的動物源和真菌源的凝乳酶在pH＜5.0情況下具有最大活性，那么在中性環境下具有高凝乳活性的凝乳酶非常適合牦牛乳奶酪的生產；第三，高溫處理是牦牛乳制作奶酪之前的必要步驟，如果高溫處理后立即添加凝乳酶，那么就縮短了前處理時間，在奶酪制備過程中，高溫環境不僅可以提高酶的反應效率，而且會減少酶的用量，節約成本。然而，傳統的凝乳酶通常只能在50℃以下的環境中保持活性的穩定(Ageitos et al.，2007；Kumar et al.，2005；Nouani et al.，2009)，而在高溫環境下會迅速失活，無法滿足牦牛奶酪加工的需要。綜上所述，傳統的凝乳酶不再適用于牦牛乳奶酪的生產過程。因此，亟須開發出一種具有熱穩定性的、高效凝結牦牛乳的凝乳酶。迄今為止，沒有文獻或專利報道過具備牦牛乳特異性、熱穩定性、并在pH6.0-8.0保持高活性的微生物源凝乳酶，更沒有明確這類蛋白質或其編碼蛋白質的基因序列。

Ageitos，J.M.，Vallejo，J.A.，Sestelo，A.B.，Poza，M.，and Villa，T.G.(2007).Purification and characterization of a milk-clotting protease from Bacillus licheniformis strain USC13.J Appl Microbiol 103，2205-2213.

Brunner，J.(1981).Cow milk proteins：twenty-five years of progress.J Dairy Sci 64，1038.

Chitpinityol，S.，and Crabbe，M.(1998).Chymosin and aspartic proteinases.Food Chem 61，395-418.

Kumar，S.，Sharma，N.，Saharan，M.，and Singh，R.(2005).Extracellular acid protease from Rhizopus oryzae：purification and characterization.Process Biochem40，1701-1705.

Li，H.M.，Ma，Y.，Dong，A.，Wang，J.，Li，Q.，He，S.，and Maubois，J.-L.(2010).Protein composition of yak milk.Dairy Sci Technol 90，111-117.