[發(fā)明專利]一種懸鉤子屬植物中期染色體熒光原位雜交方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210032586.0
• 申請(qǐng)日: 2012-02-15
• 公開（公告）號(hào): CN102559909A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王小蓉;湯浩茹;南紅;王燕;劉澤靜;陳清;陳濤;黃曉姣;何文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G01N21/64
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種懸鉤子屬植物中期染色體熒光原位雜交方法。

背景技術(shù)

熒光原位雜交(FISH)技術(shù)是70年代初開始發(fā)展起來的一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是將DNA用特殊修飾的核苷酸分子標(biāo)記(如biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP)，根據(jù)核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與染色體上相應(yīng)的序列雜交。進(jìn)行原位雜交時(shí)，先用高溫或堿處理DNA分子，使之發(fā)生變性；當(dāng)溫度下降或pH值恢復(fù)到中性，變性的DNA會(huì)按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，重新形成氫鍵恢復(fù)到原來的雙鏈結(jié)構(gòu)。如果兩條單鏈的來源不同，只有它們之間的堿基序列是同源互補(bǔ)或部分同源互補(bǔ)時(shí)，才能全部或部分復(fù)性，產(chǎn)生分子雜交。由于探針帶有熒光物質(zhì)，因此雜交的位點(diǎn)可直接在熒光顯微鏡下觀察到。利用該技術(shù)可以檢測(cè)DNA序列在染色體或DNA纖維上的定位、定性、相對(duì)定量分析。

隨著技術(shù)的發(fā)展與不斷完善，熒光原位雜交在植物上應(yīng)用于研究的優(yōu)越性越來越明顯：(1)與用放射性物質(zhì)來標(biāo)記探針的分子原位雜交相比，它不需要反射性同位素，安全可靠，不需特殊方法處理，檢測(cè)時(shí)間短，背景清晰，檢測(cè)靈敏度高，底物可長(zhǎng)期貯存而不失活；(2)與其它非放射性原位雜交技術(shù)相比，它可用不同熒光素標(biāo)記的探針與同一目的DNA進(jìn)行雜交，即進(jìn)行多重標(biāo)記，一次定位多個(gè)DNA序列；(3)雜交信號(hào)可逐級(jí)放大，進(jìn)行定量或非定量分析，并且可聽過計(jì)算機(jī)軟件圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)并處理雜交微弱的信號(hào)，使其可視化更強(qiáng)。

因此，以45S?rDNA、5S?rDNA或植物全基因組為探針的熒光原位雜交在研究動(dòng)植物系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化、識(shí)別個(gè)別染色體、提高同源染色體配對(duì)準(zhǔn)確性、進(jìn)一步闡明染色體結(jié)構(gòu)變異等重要的遺傳學(xué)問題以及鑒定雜種和檢測(cè)后代外源染色體或染色體片段存在與否等研究領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)缺陷，提供一種懸鉤子屬植物中期染色體熒光原位雜交方法。本發(fā)明的雜交方法是采用中期染色體作為靶DNA，進(jìn)行原位雜交。其技術(shù)方案為：

一種懸鉤子屬植物中期染色體熒光原位雜交方法，包括以下步驟：

1)制片：取懸鉤子根尖，預(yù)處理，固定，然后用1mol·L^-1HCl在60±0.5℃下解離40s，壓片，液氮凍片，干燥；

2)制備探針：提取選自懸鉤子植物基因組DNA或通過PCR，得到目的片段45S?rDNA或5S?rDNA，用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，制得探針；

3)雜交前預(yù)處理：依次用2％纖維素酶和2％果膠酶混合液、100μg·mL^-1的DNase-free?RNase?A、1mg·mL^-1的蛋白酶K和45％醋酸處理，再用4％多聚甲醛固定，然后依次用75％、95％、100％乙醇脫水，晾干；

4)制備雜交液：雜交液總體積為30μL：100％去離子甲酰胺15μL；50％硫酸葡聚糖6μL；20×標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽3μL；10％十二烷基磺酸鈉1μL；熒光素標(biāo)記的探針3μL；封阻DNA1μL；不足30μL時(shí)用滅菌去離子水補(bǔ)足；將雜交液混勻，于100℃變性5min，轉(zhuǎn)入冰上處理至少10min；

5)制片變性：將制片于70％甲酰胺中70℃變性3min，轉(zhuǎn)入經(jīng)-20℃冰凍的75％、95％、100％乙醇脫水，晾干；

6)雜交：將雜交液滴于制片上，加蓋玻片，封片，于37℃細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中雜交過夜；

7)檢測(cè)：用標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鈉鹽洗脫，然后加與標(biāo)記用的熒光素匹配的抗體襯染，觀察熒光信號(hào)，采集并加工雜交圖像。

其中上述步驟1)中所述的預(yù)處理是用0.002mol·L^-18-羥基喹啉在4℃下處理4h或重蒸餾水在4℃下處理24h，固定是采用卡諾氏固定液I(無水乙醇∶乙酸＝3∶1，v/v)在4℃下固定24h，壓片是用45％乙酸處理。

步驟2)中所述熒光素選用地高辛，所述探針的濃度為20～100ng·μL^-1。

步驟3)中所述的2％纖維素酶和2％果膠酶混合液處理是在37℃下溫育1.5h，DNase-free?RNaseA處理是在37℃下溫育1h，蛋白酶K處理是在37℃下溫育30min，45％醋酸處理是在室溫下處理5min，多聚甲醛處理是在室溫下固定10min，乙醇脫水時(shí)間為每級(jí)5min。

步驟4)中所述的雜交液變性是在PCR儀或沸水中進(jìn)行。

步驟5)中所述的70％甲酰胺是用2×標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽稀釋，所述的-20℃冰凍乙醇脫水時(shí)間為每級(jí)5min。