[發明專利]一種乳制品中乳鐵蛋白含量的測定方法

有效

• 申請號: 201210030215.9
• 申請日: 2012-02-10
• 公開（公告）號: CN102590418A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 孟瑾;鄭小平;韓惠雯;王霞;馬穎清;何亞斌
• 申請（專利權）人: 上海德諾產品檢測有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 鐘華;徐穎

技術領域

本發明涉及一種乳制品中乳鐵蛋白含量的測定方法。

背景技術

乳鐵蛋白(Lactoferrin?LF)又稱“乳轉鐵蛋白”，是一種具有許多生理活性的鐵結合性糖蛋白。它廣泛存在于乳汁、唾液、淚液等外分泌或血漿中性粒細胞中。

從營養成分上看，乳清蛋白占母乳總蛋白質的80％左右。這類蛋白質的氨基酸組成全面充分且比例恰當，還含有α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、免疫球蛋白、血清白蛋白等活性成分。其中，乳鐵蛋白是乳清蛋白中具有很高營養價值的活性成分。乳鐵蛋白最早是由科學家Montreuij和Johansonb于1960年在母乳乳汁中發現。美國乳品協會和一些科學家的研究表明，乳鐵蛋白是一種多功能蛋白質，具有廣譜抗菌，抗病毒感染作用，能調節體內鐵的平衡；調節骨髓細胞的生成，促進細胞的生長；調節機體免疫功能，增強機體抗病能力；抑制人體腫瘤細胞的作用；能同多種抗生素及抗真菌制劑協同作用，更有效地治療疾病。

由于乳鐵蛋白的多種特殊功能，已經在許多市售的產品中使用，其中包括嬰兒配方奶粉、運動及功能性食品、獸醫及飼料類、漱口水和牙膏等個人護理用品。乳鐵蛋白在嬰兒配方中應用，是從比較母乳及牛乳之間的不同開始的。母乳中乳鐵蛋白的濃度為0.20g/100ml，而在牛乳中為0.01g/100ml。在許多國家，乳鐵蛋白都已經是市售的一種配料。

乳鐵蛋白作為乳清蛋白中的成分，對乳清蛋白的特殊功效有重要意義，特別是添加在嬰幼兒奶粉中，對嬰兒的健康提供可靠的幫助。乳鐵蛋白出現在動物乳，特別是初乳中，為媽咪和嬰幼兒提供多種生物功能，尤其是調節免疫和對病原微生物抵御功能。大量研究證明，乳鐵蛋白能促進營養成分的吸收、消化，并保護機體面受微生物侵害，促進腸道有益菌生長，為嬰幼兒提供了第一道也是最重要的防線。乳鐵蛋白是唯一能在腸道內運載鐵離子的物質，能顯著增強對鐵的吸收和利用率。有效預防孕產婦及嬰幼兒貧血。

目前測定乳鐵蛋白含量的方法有很多種，但大致可以歸為幾類：一是需要借助抗體，如酶聯免疫法、放射免疫擴散法和免疫印記；二是根據不同分子結構的物質對電磁輻射選擇性吸收，如紫外分光光度法；三是根據離子遷移速度，如毛細管電泳技術；四是陽離子交換色譜柱進行高效液相色譜測定含量。

酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked?immunosorbent?assay，簡稱ELISA)采用ELISA測定乳鐵蛋白含量具有靈敏度高、最小檢測限低、樣品無需純化等特點但該法受環境和操作人員的影響較大，對于定量重復差；放射免疫擴散法的檢測范圍有限；準確度不高并且存在一定的放射危害；紫外分光光度法具有快速簡便的特點，但誤差大；而凝膠色譜法適用于高純度的樣品測定；而用陽離子交換色譜柱進行高效液相色譜測定方法，提高了定量的準確性，但此方法的流動相中使用了大量的NaCl，對高壓液相色譜儀來講是最忌諱的，對儀器損害非常大。

因而，探尋一種成本低廉、檢測快速、準確、適用于復雜體系乳制品中乳鐵蛋白含量的檢測方法是研究的首要問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服了酶聯免疫吸附測定法定量重復性差、紫外分光光度法誤差大、凝膠色譜法只適用于高純度樣品和高效液相色譜法測定中使用大量NaCl對儀器損害大的缺陷，提供了一種乳制品中乳鐵蛋白含量的測定方法。該測定方法改進了陽離子交換色譜柱進行高效液相色譜測定方法，利用親和層析柱作為提取樣品的工具，使用常用的C₁₈柱進行高效液相色譜測定，測定成本低，準確度和專一度高，大大節省測定時間并且具有很高的回收率。

本發明提供了一種乳制品中乳鐵蛋白含量的測定方法，其包括下述步驟：

(1)將乳制品與水的混合液離心脫脂，去除脂肪得脫脂乳液；

(2)過親和層析柱：所述的脫脂乳液通過預活化的親和層析柱，用pH為6.8～7.4的磷酸鈉緩沖液洗柱，用洗脫液①洗脫，收集洗脫液得進樣溶液；該洗脫液①為含1.0mol/L氯化鈉的磷酸鈉緩沖液，pH為6.8～7.4；

(3)將所述的進樣溶液進行高效液相色譜法檢測：洗脫液②由流動相A和流動相B組成，流動相A為乙腈，流動相B為0.1wt％的三氟乙酸水溶液，洗脫梯度如表1所示：

表1