[發明專利]一種提高CP4-EPSPS在漢遜酵母中表達量的方法

有效

• 申請號: 201210030210.6
• 申請日: 2012-02-13
• 公開（公告）號: CN102559730A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 劉德虎;王楠;李剛強;劉樹鵬
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/67
• 分類號: C12N15/67;C12N15/81;C12N15/62;C12N15/113;C12P21/00;C07K1/34;C12R1/78
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

1.一種使用復合增強子以提高CP4-EPSPS融合蛋白在漢遜酵母表達量的方法。

2.如權利要求1中的方法，其中所說的復合增強子具有序列表中的1所示的核苷酸序列。

3.如權利要求1中的方法，編碼CP4-EPSPS融合蛋白的DNA序列，其特征在于具有序列表3中所示的核苷酸序列。

4.如權利要求1中的方法，需構建一種表達質粒載體，其特征在于它含有權利要求2所述的復合增強子序列及權利要求3中所述的編碼CP4-EPSPS融合蛋白的DNA序列。

5.如權利4中所述的表達載體，其特征在于，在構建表達載體時，采用的起始載體為pPIC9K或其他能夠組成型表達并分泌重組蛋白到胞外的質粒載體。

6.如權利要求1中的方法，需要一種酵母宿主細胞，其特征在于它包含權利要求4和5中所述的表達載體。

7.如權利要求6中所述的宿主細胞，它是指漢遜酵母菌株A16或其他能夠表達外源基因的酵母菌株。

8.利用權利要求7所述的漢遜酵母菌株A16高效表達和生產CP4-EPSPS重組融合蛋白的方法，其中包括了四個階段：

1)種子液制備：挑取酵母單菌落，接種于10mL?YPD液體培養基中，37℃振蕩培養過夜后，將該培養物轉接于100mL?YPD培養基中，37℃振蕩培養24小時后，將該培養物轉接于3L?BMGY培養基中，37℃振蕩培養48小時，然后將其作為種子液；

2)初培養階段：在50L發酵罐中盛放了30L基礎發酵培養基[10×Basal?Salts：2.67％磷酸、0.093％硫酸鈣、1.82％硫酸鉀、1.49％硫酸鎂、0.413％氫氧化鉀+4％甘油]，在接種前先加入氨水使該培養基的pH值維持在4.0左右，再按照下述比例，在每升基礎發酵培養基中加入4.37mL微量鹽溶液PTM1(0.6％硫酸銅，0.008％碘化鈉，0.3％硫酸錳，0.02％鉬酸鈉，0.002％硼酸，0.05％氯化鈷，2％氯化鋅，6.5％硫酸亞鐵，0.025％生物素，0.5％硫酸)。按占基礎發酵培養基體積10％的比例接種此前制備好的種子液，37℃通氣攪拌(轉速自始至終維持在375轉/分)培養24小時左右；

3)蛋白大量表達階段：從接種后的第二天，通過蠕動泵流加補料液，補料液為50％甘油(其中含有12mL?PTM1/L)，流加量為18mL/L/天。37℃通氣攪拌培養至72h，用氨水維持pH值在4.0左右，同時調整通氣量使此階段的溶氧量始終維持在20％以上。

4)發酵液上清首先用截流分子量約為50KDa的中空纖維濾柱過濾，收集透過液，再用截流分子量為10KDa的納濾膜處理，保留回流液。用蒸餾水將回流液稀釋10倍，然后再通過10KDa的納濾膜處理，如此重復操作5次。將回流液冷凍干燥后，可得到初步提純的重組蛋白凍干粉。將其重新懸浮于50mL的20mM?Tris-HCl緩沖液中(pH7.9，含5mM咪唑，0.5MNaCl)。準備20mL的鎳柱，首先用無菌水洗柱(10倍柱床體積)，流速1mL/mim，然后用上樣緩沖液I(10mM?Tris-HCl，pH7.9，含0.25M?NaCl)進行平衡(10倍柱床體積)，流速為1mL/min。將上述蛋白樣品液以1mL/min的速度加入到柱子中。用上樣緩沖液I繼續平衡(10個柱床體積)，然后分別用含有50mM、100mM及400mM咪唑的10mM?Tris-HCl緩沖液(pH7.9，含0.25M?NaCl)進行洗脫，流速為2mL/min，收集含目標蛋白階段的洗脫液，匯合后凍干。

9.如權利要求8所述的方法，其中所述的CP4-EPSPS重組融合蛋白經高度純化后可作為蛋白質標準物質備選物應用于蛋白質溯源研究等領域。