[發明專利]生殖保健用臍帶間充質干細胞技術

無效

• 申請號: 201210030195.5
• 申請日: 2012-02-10
• 公開（公告）號: CN103243069A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發明（設計）人: 孫勇
• 申請（專利權）人: 孫勇
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/44;A61P15/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.生殖保健用臍帶間充質干細胞(human?umbilical?meschymal?stem?cell，HUMSC)技術，其特征在于：

(1)干細胞采集和加工，采集的臍帶和臍帶血在GMP車間處理并接種于T75細胞培養瓶。

(2)臍帶間充質干細胞培養及傳代，干細胞培養達對數生長期時消化，傳代并使用條件培養基培養。

(3)臍帶間充質干細胞特異誘導，HUMSC消化離心后用特異培養液培養以備移植之用。

(4)間充質干細胞移植，經質檢合格后的HUMSC以以一定的干細胞劑量移植于生殖保健者。

2.根據權利要求1所述的生殖保健用臍帶間充質干細胞技術，其特征是：(1)干細胞采集和加工，選取病毒檢測陰性的產婦并與其簽訂臍帶和臍帶血捐獻同意書，無菌條件采集臍帶血和臍帶，并于100級層流罩內留取樣品做質檢(HBsAg、HCV-Ab、TP-Ab、HIV1/2-Ab、CMV-IgM)，經過700轉/分鐘和2800轉/分鐘分別離心10分鐘和25分鐘，以去除紅細胞和血漿。臍帶組織在與臍血同樣的車間條件下去除血管和外膜，并將組織剪成1mm³大小碎塊。

3.根據權利要求1所述的生殖保健用臍帶間充質干細胞技術，其特征是：(2)臍帶間充質干細胞培養及傳代，處理完的臍帶組織塊接種于T75細胞培養瓶，以DMEM完全培養液并添加營養因子：10ng/ml?ITS(胰島素、轉鐵蛋白、硒)、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素、20ng/ml?of?rEGF、20ng/ml?of?rPDGF-bb、10ng/ml?of?LIF、20ng/ml?of?bFGF。同時加入20％的分離純化后的臍帶血干細胞，常規培養7-10天換液。間充質干細胞匯合度達80％時用0.25％胰酶-0.1％膠原酶消化，并輕叩培養瓶利用差異粘附除去成纖維細胞等。細胞重懸后傳代于經10ug/ml的纖粘素包被的T175ml培養瓶，培養液為：原培養液過濾液、分離的臍帶血和DMEM新鮮的完全培養液各三分之一體積并補充間充質干細胞營養因子，常規培養、換液及按照1∶3比例傳代。

4.根據權利要求1所述的生殖保健用臍帶間充質干細胞技術，其特征是：(3)臍帶間充質干細胞特異誘導，P3代HUMSC經胰酶-膠原酶消化后離心、重懸、接種于經纖粘素包被的100mm的培養皿，培養液：DMED完全培養液、20ng/ml?of?rEGF、20ng/ml?of?bFGF、20mU/ml的人絨毛膜促性腺激素，常規培養48小時為男性生殖系保健移植之用；女性生殖系保健移植之用的培養液只改變人絨毛膜促性腺激素為15％濃度的卵泡液。

5.根據權利要求1所述的生殖保健用臍帶間充質干細胞技術，其特征是：(4)間充質干細胞移植，經體外處理的P3代HUMSC上清液收集做質檢(革蘭氏菌涂片、厭氧菌、需氧菌培養、真菌和霉菌)，HUMSC經胰酶-膠原酶消化后離心、重懸，用DMED基礎培養液洗滌三次并質檢如有核細胞計數及活力觀察、流式檢測(CD44，CD73，CD90和CD105)、克隆集落形成實驗。簽訂知情者同意書后以3.7X10⁵/KG的HUMSC劑量經手背靜脈輸注以生殖保健。剩余的HUMSC以DMEM完全培養基加10％DMSO和1％BSA，存入-196°液氮罐保存。