[發明專利]來源于抗CypA駱駝科動物的重鏈VHH抗體基因、編碼多肽及其應用

有效

• 申請號: 201210028757.2
• 申請日: 2012-02-09
• 公開（公告）號: CN102660551A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 陳志南;汪莉;朱平;馬小魁;李郁;賈俊峰;楊向民
• 申請（專利權）人: 陳志南
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C07K16/18;A61K48/00;A61K39/395;A61P29/00;A61P19/02
• 代理公司: 西安文盛專利代理有限公司 61100
• 代理人: 彭冬英

所屬技術領域

本發明涉及生物技術及醫藥領域，尤其是抗親環素A(cyclophilin?A，CypA)抗原的羊駝重鏈VHH抗體的基因和多肽，以及所述基因和多肽的應用。?

背景技術

類風濕關節炎(rheumatoid?arthritis，RA)全球發病率1％，我國RA患者已逾500萬人。RA患者致殘率高，發病的最初2年內，約有75％的患者出現關節損害，80％的患者20年后關節變形殘疾，部分病情進展迅速，甚至導致死亡。因此，RA的治療一直是醫學界關注的焦點。近年來，RA治療藥物不斷發展，尤其是一系列新的生物制劑的應用顯著改善了RA患者的滑膜炎癥，減緩了關節損傷。然而，目前針對RA的治療藥物主要以炎性細胞因子和炎性細胞為靶點，均不能終止RA的軟骨和骨侵襲，因此，發現新的治療RA的靶點仍是RA治療的發展趨勢。?

親環素A(CypA)，一種廣泛存在的細胞內蛋白，具有肽脯胺酰順反異構酶活性。研究報道在炎癥刺激下，CypA能夠分泌至細胞外，促進炎癥反應。RA病人的血清和滑液中存在高水平的CypA，并且其濃度與病情的嚴重程度密切相關。在RA關節滑膜層內，CypA主要由巨噬細胞及內皮細胞表達，誘導TNF-α、IL-8、MCP-1和IL-1β等促炎性細胞因子的表達，同時CypA通過核轉錄因子NFκB刺激巨噬細胞表達MMP-9，促進關節軟骨的降解。以上研究表明CypA作為一種炎癥調節分子與RA的發病機制有密切關系。目前，以CypA為治療靶點的抗體類藥物仍未見報道。?

重鏈抗體是在駱駝血清中發現的一類天然缺失輕鏈的免疫球蛋白，克隆重鏈抗體的可變區得到的抗體被稱為VHH抗體。研究發現，VHH抗體具有易表達、可溶性好、穩定性強等優點。它的最大特點是能夠識別獨特構象的抗原表位，與傳統抗體相比，它的CDR3區較長，能形成豐富的抗原結合構象，適合從中篩選酶的抑制劑、受體的激動劑或拈抗劑。Marc?Lauwereys等得到的VHH抗體片段能夠抑?制碳酸酐酶和淀粉酶的活性。VHH抗體還可作為報告分子用于臨床上的組化篩選；還能夠作為生物傳感器的捕獲試劑；將VHH抗體與毒素、酶等連接構成的免疫融合物，組織穿透力強、清除快，是理想的藥物載體；VHH抗體還可作為細胞內抗體。已有研究表明VHH抗體作為一種小型化的基因工程抗體在基礎研究及藥物開發領域有廣闊的應用前景。?

噬菌體抗體庫技術是迄今發展最成熟、應用最廣泛的抗體庫技術，該技術通過構建抗體文庫，然后將抗體基因表達于噬菌體表面，用固相化抗原對表達產物的載體進行淘篩，能夠獲得任何一種高度特異性的抗體。?

發明內容

本發明的一個目的在于提供來源于抗CypA駱駝科動物的重鏈VHH抗體基因及其編碼的多肽，其重組后可表達出能夠與CypA特異性結合的抗體活性片段。?

本發明的另一個目的在于所述抗體基因或多肽在制備治療類風濕關節炎相關炎性疾病方面藥物中的應用。?

根據本發明的一個方面，本發明涉及抗CypA重鏈VHH抗體的基因。本發明所述的抗CypA重鏈VHH抗體的基因是從CypA免疫羊駝所收集的外周血淋巴細胞所構建的抗體庫中用我們原核表達的CypA抗原篩選獲得。獲得1株陽性克隆，命名為Escherichia?coli?pCANTAB5E-A1-HB2151(保藏單位：中國典型培養物保藏中心；地址：中國武漢武漢大學保藏號：CCTCC?NO：M?2011482，保藏日期：2011年12月26日)，其誘導表達的抗體活性片段命名為A1。經過序列測定和在NCBI中BLAST分析后，確認所述的來源于抗CypA駱駝科動物的重鏈VHH抗體基因，具有序列表<400>1的基因序列，其編碼的多肽具有序列表<400>2的氨基酸序列。上述基因重組后能夠表達出與CypA特異性結合的抗體活性片段。?

所述駱駝科動物選自羊駝。?

本發明所克隆的重鏈VHH抗體基因應用因特網上的基因序列數據庫NCBI對所得序列進行同源性比較和其胚系基因來源分析表明，所獲得基因確實來自駱駝胚系基因，和現有報道的各類抗體基因序列均不完全一致。?

根據本發明的另一方面，本發明還涉及所述抗體基因及其編碼多肽在制備治療類風濕關節炎相關炎性疾病藥物中的應用。?