[發明專利]犬鉤蟲抗凝肽及其制備和應用

有效

• 申請號: 201210026241.4
• 申請日: 2007-03-05
• 公開（公告）號: CN102532297A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 彭禮飛;吳亞敏;鄧莉;胡晶晶;楊陳;甘偉瓊
• 申請（專利權）人: 廣東醫學院
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12P21/02;A61K38/17;A61P7/02
• 代理公司: 湛江市三強專利事務所 44203
• 代理人: 龐愛英

本申請為申請號200710079673.0、申請日為2007年3月5日、發明名稱“犬鉤蟲抗凝肽及其制備和應用”的分案申請。?

技術領域

本發明涉及醫藥及生物技術領域。具體的說，本發明涉及從犬鉤蟲中分離到的犬鉤蟲抗凝肽新基因及其編碼的蛋白質。本發明還涉及這些新的犬鉤蟲抗凝肽的制備和應用。?

技術背景

血栓性疾病是一種常見病，常表現為心肌梗死、缺血性腦梗死、靜脈血栓栓塞。每年每一千人中有1～3人發生不同形式的血栓性疾病。在當前人類疾病中，血栓栓塞性疾病已成為危害人類健康的主要因素，由血栓栓塞所致的心肌梗死、腦梗死、肺梗死等其死亡總數為各種病因之首。如何防治該類疾病是目前臨床與醫藥科學研究的熱點，盡管有肝素、口服香豆素、鏈激酶和尿激酶等藥物多年應用的歷史，但這些藥品的出血、血小板減少等副作用限制了其應用，有的用藥時還需要特別監測。因此開發出療效好、毒副作用低的血栓性疾病防治藥物倍受科研人員的關注。目前臨床上治療血栓性疾病的藥物主要分為抗血小板類藥物、抗凝血藥物和溶血栓藥物三大類。其中，抗凝血藥是一類干擾凝血因子，是阻止血液凝固的藥物，主要用于血栓栓塞性疾病的預防與治療，特別使用于栓塞性疾病的預防。肝素類(如低分子量肝素LMWH)藥物是目前市場上占主要地位的抗凝血藥物，如世界上每年有6000萬病人接受肝素治療以防治急性冠脈綜合癥等各種血栓性疾病。?

鉤蟲寄生于人或動物宿主腸道，引起宿主慢性失血，從而導致宿主貧血。其中原因之一是鉤蟲能分泌抗凝物質，使宿主被鉤蟲咬附傷口不易凝血，血液并迅速經鉤蟲消化道排出。早在20世紀初，就有學者證實了犬鉤蟲(Ancylostoma?caninum)提取物具有抗凝作用，但直到1993年才從犬鉤蟲中分離出首個抗凝血肽，其后并證實該抗凝血肽可顯著延長凝血酶原時間(PT)和活化部分凝血酶原激酶時間(aPTT)。該抗凝肽被命名為犬鉤蟲抗凝肽(Ancylostoma?caninum?anticoagulant?peptide，AcAP)，也稱線蟲抗凝血肽(nematode?anticoagulant?peptide，NAP)或線蟲抗凝血蛋白(nematode?anticoagulant?protein，NAP)。1996年，Stassens等根據測得抗凝肽部分氨基酸序列設計核酸探針，從犬鉤蟲cDNA文庫中篩選到三個抗凝血肽基因，它們在Pichia?pastoris中的表達產物rAcAP5(rNAP5)、rAcAP6(rNAP6)和rAcAPc2(rNAPc2)均顯著延長PT，并成劑量依賴關系。其中，延長PT活性以rAcAPc2(rNAPc2)為最好，延長aPTT活性以rAcAP5(rNAP5)為最好，rAcAP6(rNAP6)抗凝活性略弱于rAcAP5(rNAP5)(Stanssens?P，P?W?Bergum，Y?Gansemans?et?al.Anticoagulant?repertoire?of?the?hookworm?Ancylostoma?caninum.Proc?Natl?Acad?Sci?USA.1996；93：2149～2154.)。2002年，Stassens等報道了采用cDNA末端快速擴增技術，從錫蘭鉤蟲(Ancylostoma?ceylanicum)中得到了抗凝血肽AceAP1基因，并在大腸桿菌中表達獲得了rAceAP1，其抗凝活性遠較rAcAP5(rNAP5)、rAcAP6(rNAP6)?和rAcAPc2(rNAPc2)低(Harssion，L.M.，Nerlinger，r.D.Bungiro?et?al.Molecular?characterization?of?Ancylostoma?inhibitors?of?coagulation?factor?Xa.Hookworm?anticoagulant?activity?in?vitro?predicts?parasite?bloodfeeding?in?vivo[J].J.Biol.Chem，2002；277(8)：6223-29)。2004年，Juliusz等人報道了根據AcAPc2信號肽氨基酸保守序列設計引物，采用RT-PCR從犬鉤蟲中獲得兩種同源多肽，并分別命名為AcAPc3、AcAPc4，重組表達產物rAcAPc3、rAcAPc4抗凝活性明顯不及rAcAPc2(rNAPc2)(Mieszczanek?J，Harrison?L?M，Vlasuk?G?P?and?Cappello?M.Anticoagulant?peptides?from?Ancylostoma?caninum?are?immunologically?distinct?and?localize?to?separate?structures?within?the?adult?hookworm.Mol?Biochem?Parasitol.2004；133(2)，319-323)。最近，本發明人也公開了犬鉤蟲抗凝肽AcaNAP7基因序列(GenBank錄入號：DQ435781)、AcaNAP8(GenBank錄入號：DQ435782)，并實驗證實它們的重組表達產物具有很好抗凝活性(申請者待發表的結果但是還未公開)。鉤蟲抗凝肽及其重組產物具有明確的抗凝血作用，其抗凝作用機制已引起人們的重視并被探討應用于臨床實踐。rAcAPc2(rNAPc2)和rAcAP5(rNAP5)的臨床或臨床前試驗表明它們具有廣闊的應用前景，是目前倍受醫藥專家關注的正在開發的抗凝抗血栓藥物。?