[發(fā)明專利]無(wú)CO2條件下誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化成骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210025449.4
• 申請(qǐng)日: 2012-02-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102586181A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王金福;陳鍵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種無(wú)CO₂條件下誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

(二)背景技術(shù)

細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)歷了約一百年的發(fā)展歷史，并從上世紀(jì)五十年代后期開(kāi)始得到飛速發(fā)展。作為生物學(xué)研究最基本的技術(shù)手段，細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域。目前細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)通常包括：常規(guī)培養(yǎng)基(含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的各類氨基酸、糖類、無(wú)機(jī)鹽、維生素等)、10％血清、20％O₂、5％CO₂和37℃恒溫等。CO₂是提供細(xì)胞正常生長(zhǎng)所需的成分，但它必須與常規(guī)培養(yǎng)基中的高濃度碳酸氫鈉聯(lián)用，構(gòu)成緩沖體系，來(lái)維持pH穩(wěn)定。如果培養(yǎng)環(huán)境中無(wú)CO₂，則培養(yǎng)基中的碳酸氫鈉會(huì)迅速分解為碳酸鈉，使pH過(guò)高導(dǎo)致細(xì)胞死亡。隨著生物學(xué)研究的深入及研究領(lǐng)域的擴(kuò)展，傳統(tǒng)培養(yǎng)基已經(jīng)難以滿足一些特殊條件下研究的需求，因?yàn)楹芏鄷r(shí)候往往需要在無(wú)CO₂條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化，這在利用航天器搭載進(jìn)行太空細(xì)胞生物學(xué)研究中尤為突出。

我國(guó)航天技術(shù)已躋身世界領(lǐng)先地位，并正式實(shí)施啟動(dòng)了一系列空間生命科學(xué)研究。然而，人類在太空失重環(huán)境下長(zhǎng)期工作和生活會(huì)導(dǎo)致失重性的骨質(zhì)變化，主要表現(xiàn)為骨量減少，骨礦度降低，鈣排出增多，血鈣升高，出現(xiàn)負(fù)鈣平衡，導(dǎo)致骨密度下降和骨質(zhì)疏松，最終使骨力學(xué)性能下降，骨折風(fēng)險(xiǎn)增高。大量研究表明，微重力環(huán)境導(dǎo)致人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向骨細(xì)胞方向分化的潛能降低是引起骨質(zhì)變化的重要原因。因此，有必要利用各種航天器的搭載條件，進(jìn)行真實(shí)太空環(huán)境下空間微重力影響骨細(xì)胞分化的生物學(xué)效應(yīng)及其分子機(jī)制的研究，對(duì)今后開(kāi)展人類在深空微重力環(huán)境下骨質(zhì)變化的預(yù)防和治療研究以及藥物開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)具有至關(guān)重要的作用。然而，由于受到航天器搭載的有效載荷、容積、裝置設(shè)計(jì)以及安全等因素的限制，往往無(wú)法搭載CO₂儲(chǔ)存罐來(lái)提供空間細(xì)胞培養(yǎng)所需的高濃度CO₂。因此，設(shè)計(jì)一種在無(wú)CO₂環(huán)境下能正常培養(yǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化的方法具有重要的科學(xué)和技術(shù)意義。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種在無(wú)CO₂條件下，能體外正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化成骨細(xì)胞的新型培養(yǎng)方法。

本發(fā)明是通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)培養(yǎng)基進(jìn)行改造，調(diào)整其關(guān)鍵緩沖鹽體系的成分及濃度，從而達(dá)到在無(wú)CO₂的特殊條件下，正常培養(yǎng)并誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化成骨細(xì)胞的目的。本發(fā)明通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)：

一種無(wú)CO₂條件下誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法，所述方法包括：

(1)收集培養(yǎng)至第3代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×10⁵個(gè)/ml，制備得到細(xì)胞懸液；

(2)將步驟(1)細(xì)胞懸液以0.5ml/孔接種至24孔板中，5％CO₂、37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜；

(3)待細(xì)胞完全貼壁并生長(zhǎng)到大約80％融合時(shí)，更換本發(fā)明新型誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在無(wú)CO₂、37℃條件下培養(yǎng)14～21天，獲得成骨細(xì)胞；所述本發(fā)明新型誘導(dǎo)培養(yǎng)基由本發(fā)明新型基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加常規(guī)胎牛血清、青霉素、鏈霉素、地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C制成，所述本發(fā)明新型基礎(chǔ)培養(yǎng)基按如下終濃度組成配制：碳酸氫鈉0.41g/L；十二水合磷酸氫二鈉1.5g/L；磷酸二氫鉀0.07g/L；氯化鈉8.17g/L；溶劑為不含碳酸氫鈉的L-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基。

常規(guī)情況下，間充質(zhì)干細(xì)胞的傳統(tǒng)培養(yǎng)基為L(zhǎng)-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco公司，貨號(hào)11885084)，其主要成分包括：各類氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽(含3.7g/L碳酸氫鈉)、葡萄糖(1000mg/L)、丙酮酸等。其中，無(wú)機(jī)鹽既是細(xì)胞正常生長(zhǎng)所必需的成分，又能構(gòu)成緩沖體系，維持培養(yǎng)液pH穩(wěn)定。在上述傳統(tǒng)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加一定濃度的胎牛血清、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素、C青霉素和鏈霉素，即可制備誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化成骨細(xì)胞的傳統(tǒng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基。