[發明專利]一種檢測ADAMTS13酶活性的熒光底物及檢測方法

無效

• 申請號: 201210024435.0
• 申請日: 2012-02-03
• 公開（公告）號: CN102533937A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 蘇健;白霞;阮長耿
• 申請（專利權）人: 蘇州大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;C07K14/47;C07K1/107
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 常亮;李辰

1.一種檢測ADAMTS13酶活性的熒光底物，其特征在于，包括如SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列，并且其氨基酸序列N端第4位和第15位的半胱氨酸的巰基結合有熒光基團。

2.根據權利要求1所述熒光底物，其特征在于，所述熒光基團為熒光素-5-馬來酰亞胺。

3.一種檢測ADAMTS13酶活性的熒光底物的制備方法，其特征在于，制備具有如SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列的蛋白，然后用能與巰基結合的熒光基團修飾蛋白即得。

4.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于，所述制備具有編碼SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列的蛋白的方法具體包括：

步驟1：制備編碼VWF73的核苷酸序列，與T載體連接，獲得重組T載體；

步驟2：雙酶切步驟1所得的重組T載體，收集VWF73片段，與pQE30表達載體雙酶切所得的大片段重組，獲得pQE30-VWF73重組載體；

步驟3：將步驟2所得的pQE30-VWF73重組載體中的VWF73片段N端第4位和第15位的氨基酸定點突變為半胱氨酸，然后再刪除pQE30-VWF73重組載體中VWF73片段N端額外氨基酸序列GS，獲得pQE30-VWF73突變重組載體；

步驟4：將獲得的pQE30-VWF73突變重組載體轉化宿主細胞，誘導蛋白表達，分離純化表達的蛋白即得。

5.根據權利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟1所述制備編碼VWF73片段的核苷酸序列具體為用具有SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ?ID?NO：4所示的核苷酸序列的下游引物擴增。

6.根據權利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟3具體包括以下步驟：

A：以pQE30-VWF73重組載體為模板，用具有SEQ?ID?NO：5所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ?ID?NO：6所示的核苷酸序列的下游引物擴增，甲基酶消化模板，獲得pQE30-VWF73重組載體中VWF73片段N端的第4位突變為半胱氨酸的質粒；

B：以pQE30-VWF73重組載體中VWF73片段N端的第4位突變為半胱氨酸的質粒為模板，用具有SEQ?ID?NO：7所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ?ID?NO：8所示的核苷酸序列的下游引物擴增，甲基酶消化模板，獲得pQE30-VWF73重組載體中VWF73片段N端第4位和第15位突變為半胱氨酸的質粒；

C：以pQE30-VWF73重組載體中VWF73片段N端第4位和第15位突變為半胱氨酸的質粒為模板，用具有SEQ?ID?NO：9所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ?ID?NO：10所示的核苷酸序列的下游引物擴增，甲基酶消化模板，獲得刪除VWF73片段N端額外氨基酸序列GS的pQE30-VWF73-突變重組載體。

7.根據權利要求6所述制備方法，其特征在于，步驟2所述雙酶切為Bam?HI和Hind?III雙酶切。

8.根據權利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟4所述宿主細胞為大腸桿菌M15菌株。

9.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于，所述能與巰基結合的熒光基團為熒光素-5-馬來酰亞胺。

10.根據權利要求9所述制備方法，其特征在于，所述用能與巰基結合的熒光基團修飾蛋白為取具有如SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列的蛋白，加入3倍摩爾量的磷酸三(β-氯乙基)酯和10倍摩爾量的熒光素-5-馬來酰亞胺，4℃暗室反應過夜，之后裝入透析袋，用pH7.520mmol/L?Tris-HCl緩沖液透析過夜，然后用聚乙二醇-20000濃縮蛋白即得。

11.權利要求1所述熒光底物在檢測ADAMTS13酶活性中的應用。

12.一種檢測ADAMTS13酶活性的方法，其特征在于，取待測血漿樣品與過量的權利要求1所述熒光底物在反應緩沖液中混合，然后在所述熒光底物所結合熒光基團相應的激發光波長和發射光波長下，檢測反應體系的熒光強度，按照標準曲線法計算待測血漿樣品中ADAMTS13酶活性。

13.根據權利要求12所述檢測方法，其特征在于，所述熒光底物用量為2.1μmol。