[發(fā)明專利]一種鑒別綠蓋裘氏牛肝菌的特異引物及鑒別方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210024102.8
• 申請日: 2012-02-03
• 公開（公告）號: CN102559907A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙永昌;李樹紅;柴紅梅;田果廷;趙靜
• 申請（專利權(quán)）人: 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責(zé)任公司 53100
• 代理人: 金耀生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種綠蓋裘氏牛肝菌（Chiua?virens?(W.?F.?Chiu)?Yan?C.?Li?&?Zhu?L.?Yang）的PCR?鑒別方法及其特異引物，屬于利用分子生物學(xué)方法鑒別食毒不清牛肝菌技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

云南多元的立體氣候和復(fù)雜的生境孕育了豐富的野生菌資源，這些資源在增加山區(qū)農(nóng)戶家庭收入中有重要的作用，有的偏遠(yuǎn)地區(qū)，野生菌的收入約占家庭年收入1/3-1/2。在野生菌資源中牛肝菌資源是分布最廣、種類最多、形態(tài)相似性較高、形態(tài)學(xué)鑒定相對較難、資源量最大的類群。牛肝菌類群真菌組織呈肉質(zhì)，易生蟲和腐爛，所以為了便于儲藏和攜帶，牛肝菌常常被加工成干片銷售，而牛肝菌經(jīng)加工成干片后形態(tài)變化大，導(dǎo)致品質(zhì)高的和品質(zhì)低的混淆，有毒種和可食種或食毒不清的種混淆，導(dǎo)致野生食用菌產(chǎn)品混淆嚴(yán)重，品質(zhì)層次不齊，給消費(fèi)者人生安全帶來潛在危害。

綠蓋裘氏牛肝菌（C.?virens）在云南分布區(qū)域廣、產(chǎn)量高、可食性不清楚，采集者和中間貿(mào)易商常常將其加工成干片混于其它可食或品質(zhì)較高的牛肝菌中銷售，偶有造成中毒事件發(fā)生。而目前鑒別綠蓋裘氏牛肝菌的方法主要是形態(tài)學(xué)分類法。要從混雜的商品牛肝菌中準(zhǔn)確鑒別出食毒不清的綠蓋裘氏牛肝菌需要有一定大型真菌分類學(xué)基礎(chǔ)，但消費(fèi)者往往不具備這方面的知識，因此，一方面導(dǎo)致中毒事件的發(fā)生，另一方面，縱容了不法經(jīng)銷商。目前，國內(nèi)對綠蓋裘氏牛肝菌的研究主要集中的形態(tài)分類及系統(tǒng)學(xué)研究方面，應(yīng)用其特異引物對該菌進(jìn)行快速鑒別或檢測的研究未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種綠蓋裘氏牛肝菌鑒別的PCR方法及其特異引物，是對綠蓋裘氏牛肝菌或混合牛肝菌進(jìn)行快速鑒別的方法。

?

每一個物種都有其獨(dú)有的遺傳物質(zhì)DNA，它不會隨環(huán)境及表型變化而變化。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，在細(xì)胞外進(jìn)行物種特有DNA片段或序列操作成為了現(xiàn)實(shí)，即運(yùn)用物種的特異引物，通過PCR擴(kuò)展，并應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測其特有片段，實(shí)現(xiàn)物種的快速鑒別成為現(xiàn)實(shí)。

一種鑒別綠蓋裘氏牛肝菌的特異引物CVf和CVr，其DNA?序列為：

CVf：?CTT?ACC?GAA?CGG?AMG?GGA?TAA?CAC?C

?CVr：?AGA?AGC?AAA?GNA?CAG?GAA?AAG?CAT?A

用上述一對特異引物鑒別綠蓋裘氏牛肝菌的方法按以下步驟進(jìn)行：

1）牛肝菌樣品DNA提取；

2）以上述DNA為模板，用特異引物CVf和CVr進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件：94℃變性5?min，然后進(jìn)入35個循環(huán)（94℃變性1?min，55℃退火0.4?min，72℃延伸0.4?min），循環(huán)結(jié)束后于72℃延伸5?min；

3）取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠上電泳，銹化乙錠染色，紫外透射儀檢測擴(kuò)增片段有無及大小，鑒別牛肝菌中是否混有食毒不清的綠蓋裘氏牛肝菌。

本發(fā)明的方法采用一對特異引物，通過PCR反應(yīng)即能有效地鑒別混合牛肝菌中是否混有綠蓋裘氏牛肝菌。本發(fā)明方法不需要對PCR產(chǎn)物測序，具有快速和準(zhǔn)確的特點(diǎn)，一般從拿到牛肝菌混合樣品到出鑒定結(jié)果僅需2-3小時。

附圖說明

圖1為?應(yīng)用特異引物PCR擴(kuò)增牛肝菌混合樣品產(chǎn)物的DNA片段瓊脂糖凝膠電泳圖，表1為圖1序號注釋。

表1

序號ABM樣品表2表3DNA Mark