[發明專利]一種谷氨酸轉運蛋白-1基因的cRNA 原位雜交探針及其制備方法

無效

• 申請號: 201210022006.X
• 申請日: 2012-02-01
• 公開（公告）號: CN102643897A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 魏燕燕;黃靜;陳晶;王文;李云慶;武勝昔
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

1.一種谷氨酸轉運蛋白-1基因的cRNA原位雜交的探針，其特征在于，該探針的序列為：

5′TCCTGCCTCTCCTCTACTTCCTGGTAACCCGGAAGAACCCCTGGGTTTTCATTGGAGGGTTGCTGCAAGCACTCATCACAGCCCTGGGGACCTCCTCAAGTTCTGCCACCCTGCCCATCACTTTCAAGTGCCTGGAAGAAAACAATGGTGTGGACAAACGCATCACCAGATTTGTGCTTCCCGTGGGGGCCACCATTAACATGGATGGGACCGCCCTCTACGAGGCTTTGGCCGCCATTTTCATCGCTCAAGTTAACAACTTTGACCTGAATTTTGGACA?3′。

2.如權利要求1所述探針的制備方法，其特征在于：

(1)根據谷氨酸轉運蛋白-1的Gene?bank序列我們設計了谷氨酸轉運蛋白-1特異的引物，并且此對引物擴增出280bp的谷氨酸轉運蛋白-1片段作為谷氨酸轉運蛋白-1特異的探針序列；

(2)構建谷氨酸轉運蛋白-1的cRNA原位雜交的探針質粒；將探針質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序；

(3)制備谷氨酸轉運蛋白-1的cRNA原位雜交探針；

(4)檢測谷氨酸轉運蛋白-1的cRNA探針的原位雜交。

3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中谷氨酸轉運蛋白-1特異的引物是：

上游引物是5′TCCTGCCTCTCCTCTACTTC?3′；

下游引物是5′GTCCAAAATTCAGGTCAAAG?3′。

4.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)按照如下步驟進行：

(a)將大鼠的cDNA用設計的引物進行PCR擴增；

(b)將PCR產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收；

(c)將回收后的產物于4℃與多克隆位點兩端具有T7，SP6啟動子的載體進行連接；

(d)將連接好的質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序。

5.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)按照如下步驟進行：

(a)步驟(2)得到的細菌測序正確后，經判斷確認谷氨酸轉運蛋白-1探針序列插入載體的順序是反向的；

(b)需要使用Xba?I限制性內切酶對質粒進行酶切；

(c)將酶切產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收；

(d)用T7RNA聚合酶對探針進行體外轉錄標記。

6.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)按照如下步驟進行：

(a)將大鼠用0.4％戊巴比妥鈉深麻后，經左心室插管至升主動脈，用0.01mol/L的DEPC-PBS的快速沖洗去除血液，再以4％多聚甲醛灌注固定；所述的0.01mol/L?DEPC-PBS是2.9克磷酸氫二鈉，0.29克磷酸二氫鈉，9.0克氯化鈉用超純水定容至1L后，再加入體積百分比為0.1％的DEPC?1ml放置過夜后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；所述4％的多聚甲醛是40.0克多聚甲醛加入500.0ml蒸餾水加熱使之解聚溶解后，再加入500.0ml的0.2mol/L?PB緩沖液定容至1000ml；所述0.2mol/L?PB緩沖液是用29.01克磷酸氫二鈉，2.96克磷酸二氫鈉加超純水定容至500ml配制而成；

(b)取材后進行腦組織的后固定：于4℃，用4％的多聚甲醛后固定24小時；

(c)將固定好的組織進行切片：將組織切成25～30μm組織切片，并將切好的切片保存于0.01mol/L的DEPC-PBS中，放于4℃冰箱備用；

(d)將切好的組織片用0.01mol/L的DEPC-PBS清洗1次，室溫，每次5-10分鐘；

(e)將上述清洗過的片子用5xSSC清洗2次，室溫，每次5-10分鐘；所述5xSSC是由20xSSC用超純水稀釋的，20xSSC為一種檸檬酸緩沖液；

(f)將5xSSC清洗后的組織片浸入預雜交液中，于55℃，在雜交爐孵育1-2小時；

所述預雜交液是由5ml的去離子甲酰胺，2.5ml的20xSSC溶液，200μl的50xDenhardt’s溶液，50μl的濃度為200mg/ml的Heparin溶液，100μl的濃度為10mg/ml的tRNA溶液，100μl的濃度為10％的CHAPS溶液，100μl的濃度為10％的Tween-20溶液，100μl的濃度為0.5mol/L的pH8.0的EDTA溶液和1.85ml的DEPC-H₂O混合配制而成；所述50xDenhardt’s為一種常用的雜交試劑；

所述200mg/ml的Heparin為200mg的Heparin粉末溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成；所述10mg/ml的tRNA為10mg的tRNA粉末溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成；所述10％的CHAPS為1g的CHAPS溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成；

所述10％的Tween-20為100μl的Tween-20溶于900μl的DEPC-H2O中配制而成；所述0.5mol/L的pH8.0的EDTA為186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉加入800ml的DEPC-H2O中在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調pH值至8.0然后定容至1L配制而成高壓滅菌備用；所述DEPC-H₂O為1L超純水加入體積百分比為0.1％的DEPC?1ml，放置過夜并高壓滅菌處理后的水；

(g)將預雜交孵育后的組織切片浸入雜交液中，于55℃，在雜交爐中孵育16-20小時；所述雜交液是上述預雜交液中加入終濃度為1.0ug/ml的cRNA探針配置成的；

(h)雜交后用1xSSC洗滌雜交的組織切片，37℃，2次，每次10分鐘；

(i)用2xSSC洗滌上述的組織切片，37℃，2次，每次10-15分鐘；

(j)用10ug/ml的RNase?A處理，37℃，1次，每次30-40分鐘；

(k)用2xSSC洗滌上述的組織切片，室溫，1次，每次10分鐘；

(l)用0.01mol/L?PBS洗滌上述的組織切片，室溫，1次，每次10分鐘；所述0.01mol/L?PBS是2.9克磷酸氫二鈉，0.29克磷酸二氫鈉，9.0克氯化鈉用超純水定容至1L配置的磷酸緩沖液；

(m)按1∶2000的抗體效價，在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗體，對洗滌后的組織切片進行孵育，室溫，放置過夜；

(n)將經過上步抗體孵育的組織片用0.01mol/L?PBS洗滌，于室溫，清洗3次，每次10-15分鐘；

(o)用TS9.5洗滌上述PBS洗滌后的組織片，室溫，清洗2次，每次15-20分鐘；所述TS9.5為是由終濃度為摩爾濃度為0.1mol/L?Tris-HCl(PH?9.5)，摩爾濃度為0.1mol/L?NaCl溶液和摩爾濃度為50mmol/LMgCL₂用超純水配制而成；

(p)將上述切片放于NBT-BCIP反應液中避光孵育4～6小時，在此過程中觀察切片呈色強度；所述NBT-BCIP是一種Roche公司生產的呈色反應液；

(q)當呈色完成后，將切片用PBS清洗3次，室溫，每次10-15分鐘；

(r)將上述洗滌后切片表于載玻片上；

(s)晾干切片，再經過二甲苯脫色，封片，以備觀察。