[發明專利]根據蛋白質-DNA復合物晶體結構設計新型TALE的方法

在審

• 申請號: 201210021012.3
• 申請日: 2012-01-04
• 公開（公告）號: CN103193871A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發明（設計）人: 顏寧;施一公;鄧東;閆創業
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/70;C07K19/00;C12N15/00;A61K38/16;A61P31/14;A61P35/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;郭文潔

本發明涉及根據蛋白質?DNA復合物晶體結構設計新型TALE的方法。本發明提供了設計特異識別DNA的TALE蛋白的方法。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地說，涉及根據蛋白質-DNA復合物晶體結構設計新型TALE的方法。

背景技術

TALEs(Transcription Activator Like Effectors，轉錄激活子樣效應因子)是植物致病菌(Xanthomonas)細胞內的一種蛋白質。當病原菌侵染植株時，病菌會通過其自身的III型分泌系統將包括TALE在內的一系列效應分子注入到植物細胞內。這些效應分子通過影響宿主細胞的信號傳遞，基因表達等方式來協助病菌進一步擴增。TALE則是這些效應分子中最大的一類，它像植物基因的轉錄激活子一樣行使功能。

TALE家族蛋白一般由3個主要的功能結構域組成，N端結構域與TALE的分泌轉運有關；C端具有轉錄激活結構域和入核信號肽片段；位于TALE中部的區域是DNA結合結構域，但它的DNA結合結構域不同于其他已知的DNA結合結構域，它是由一段串聯的重復單元組成，大多數情況下每個重復單元由34個氨基酸組成，個別重復單元由33或35個氨基酸殘基組成。這34個氨基酸中除了第12，13位的氨基酸變化較大之外，其他氨基酸高度保守。這兩個不保守的氨基酸被命名為RVD(repeat variable diresidue，重復可變雙殘基)。2009年的兩篇文章分別通過實驗和生物信息學研究發現每個重復序列中12，13位的氨基酸和識別的核苷酸種類有特殊的對應關系，比如：

TALE蛋白的特異DNA序列識別以及靈活的可組裝性為它們在分子生物學中的應用提供了巨大的前景，科學家們可以設計組裝任意的TALE單元去識別任意的DNA雙螺旋序列。這一特性已經被用來構造切割特異雙鏈DNA序列的DNA酶TALEN(TALE nuclease，TALE核酸酶)，用于在細胞基因組中引入定點突變、定點敲除等操作。在目前所有已知的報道中，TALE識別的都是雙鏈的DNA螺旋(dsDNA)。然而在沒有結構結構信息之前，并不知道如何組裝、改造TALE蛋白；

發明內容

發明人在世界上首次解析了一個經過改造的TALE蛋白dHax3在沒有DNA(圖8)和結合DNA(圖9)情況下的兩個高分辨率晶體結構。

發明人成功解析了一個經過改造的TALE蛋白dHax3DNA結合域與dsDNA的晶體結構。通過對該結構的分析和對比除了不僅揭示出TALEdHax3蛋白每一個組裝單元特異識別每一個DNA堿基的分子基礎，還顯示雙鏈DNA里只有一條編碼鏈與TALE相互作用。

發明人通過生物化學實驗發現TALE蛋白可以特異識別甲基化的DNA，并成功解析了dHax3蛋白與包含了5-甲基胞嘧啶的DNA雙鏈(5mC-dsDNA)復合體的晶體結構。

本發明提供了一種設計新型TALE蛋白組裝單元的方法，包括以下步驟：

1)位于組裝單元第16、17位的殘基采用側鏈含有氫鍵供體基團或堿性的氨基酸，例如Arg，Lys，His，Asn，Gln；

2)位于組裝單元第12位的殘基采用側鏈含有氫鍵供體基團，例如His，Asn，Gln，Ser，Thr，Tyr，Lys，Arg；

3)對于堿基腺嘌呤A，組裝單元第13位的殘基選自Asn，Asp，Gln，Glu，Ser，Thr；

4)對于堿基鳥嘌呤G，組裝單元第13位的殘基選自Asn，Gln，Asp，Glu，His，Lys，Arg，Ser，Thr；