[發明專利]抗鰻弧菌卵黃抗體及其制備方法、效價檢測方法和應用

有效

• 申請號: 201210019152.7
• 申請日: 2012-01-20
• 公開（公告）號: CN102532312A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 李登峰;周永強;劉聯國;郭安南;彭嬌;陳炯;顧曉英
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C07K16/02;G01N33/569;A61K39/40;A61P31/04
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

1.一種抗鰻弧菌卵黃抗體，其特征在于：采用鰻弧菌為抗原免疫蛋雞，收集高免疫雞蛋，將免疫雞蛋卵黃進行分離和純化得到抗鰻弧菌卵黃抗體。

2.一種根據權利要求1所述的抗鰻弧菌卵黃抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）制備鰻弧菌抗原并滅活

接種鰻弧菌于LB固體瓊脂培養基，28℃倒置培養18h后，挑取單菌落接種于LB液體培養基中，在28℃，160rpm的條件下，搖床振蕩培養10h后，調節LB液體培養基中的鰻弧菌菌量為2×10⁹CFU/ml，然后離心分離得到含有鰻弧菌的沉淀物和上清液，將沉淀物與無菌生理鹽水混合得到鰻弧菌菌量為2×10⁹CFU/ml的菌懸液，加入甲醛使甲醛體積終濃度達0.5%，然后37℃恒溫水浴滅活24h，即得到滅活的鰻弧菌抗原，放4℃冰箱備用；

(2)?免疫蛋雞并收集雞蛋

將蛋雞進行1次基礎免疫和2～3次加強免疫，所述的基礎免疫為在步驟（1）得到的鰻弧菌抗原中加入等量的弗氏完全佐劑，充分乳化后對蛋雞進行注射免疫，所述的加強免疫為在步驟（1）得到的鰻弧菌抗原中加入等量的弗氏不完全佐劑，充分乳化后對蛋雞進行注射免疫，每次免疫間隔15天，完成免疫后10天，開始收集雞蛋，于4℃冰箱保存；

（3）卵黃抗體分離和純化

將步驟（2）得到的免疫雞蛋用酒精擦拭蛋殼并分離卵黃，然后在卵黃中加入卵黃體積10倍的乙酸-乙酸鈉緩沖液，混勻后于4℃冰箱靜置10h，然后在4℃，10000g條件下離心20min，得到初提純液，將初提純液進行鹽析，將鹽析得到的沉淀用與卵黃等體積的濃度為0.01mol/L的pH為?7.2的PBS緩沖液重懸，最后用截留量為100KD的透析袋透析除鹽得到抗鰻弧菌卵黃抗體。

3.根據權利要求1所述的抗鰻弧菌卵黃抗體的制備方法，其特征在于步驟（3）中所述的鹽析過程為：首先向初提純液中加入終飽和度為40%的飽和(NH₄)₂SO₄????，4℃冰箱靜置10h后，4℃，10000g，離心20min得到一次沉淀；然后將一次沉淀用140g/LNa₂SO₄重懸浮，4℃冰箱靜置10h后，4℃，10000g，離心20min得到二次沉淀，所述的二次沉淀即為鹽析得到的沉淀。

4.一種根據權利要求1所述的抗鰻弧菌卵黃抗體的效價檢測方法，其特征在于采用間接酶聯免疫吸附試驗檢測抗鰻弧菌卵黃抗體的效價，具體包括如下步驟：以10⁹CFU/ml鰻弧菌包被酶標板，4℃冰箱靜置過夜，次日傾去孔內液體，將孔用PBST洗滌液洗滌3次后加入含1%BSA的封閉液，室溫封閉1h，洗滌3次后加入倍比稀釋的抗鰻弧菌卵黃抗體，每梯度設1平行，同時設立空白對照和陰性對照，37℃恒溫水浴2h后，洗滌3次，加入辣根過氧化酶標記的羊抗雞二抗，37℃恒溫水浴1h，洗滌5次后加入OPD顯色液顯色15min，H₂SO₄終止反應后用酶標儀讀取波長492nm吸光值，待測樣品與陰性對照吸光值大于2.1判定為陽性，最大陽性稀釋度為抗體效價。

5.根據權利要求1所述的抗鰻弧菌卵黃抗體的效價檢測方法，其特征在于：PBST洗滌液為吐溫-2000與PBS緩沖液按體積比1:2000的比例混合得到。

6.一種根據權利要求1所述的抗鰻弧菌卵黃抗體的應用，其特征在于：該鰻弧菌卵黃抗體可用于由鰻弧菌引起的疾病的預防和治療上，并可用于開發鰻弧菌檢測試劑盒和免疫學上的免疫反應及診斷。