[發明專利]甲魚系統性敗血癥球狀病毒的雞胚培養方法

有效

• 申請號: 201210019141.9
• 申請日: 2012-01-20
• 公開（公告）號: CN102628031A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發明（設計）人: 李登峰;周永強;劉聯國;彭嬌;陳炯
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;C12R1/93
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

1.一種甲魚系統性敗血癥球狀病毒的雞胚培養方法，其特征在于：采用SPF雞胚作為甲魚系統性敗血癥球狀病毒的體外培養體系，選擇預先培養了4～6天的健康雞胚，將預先制備好的甲魚系統性敗血癥球狀病毒接種液接種至雞胚卵黃囊膜內，繼續培養直至雞胚出現死亡，收集死亡雞胚進行勻漿離心分離，得到含甲魚系統性敗血癥球狀病毒的上清液，所述的甲魚系統性敗血癥球狀病毒的毒株為P1015株，保藏號為?CGMCC?No.5378，于2011年10月21日保藏在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心。

2.根據權利要求1所述的甲魚系統性敗血癥球狀病毒的雞胚培養方法，其特征在于具體的操作步驟如下：

（1）選取符合SPF規格的新鮮種蛋，氣室向上38℃孵化，相對濕度50%，每4小時翻蛋一次，培養4～6天后，選取血管粗大且呈鮮紅色的健康發育良好的雞胚在暗室內畫出氣室邊緣并標明大血管所處位置，以備病毒接種用；

（2）選取患系統性敗血癥的甲魚若干只，取甲魚內臟，按質量體積比1g：10ml比例將甲魚內臟加入到pH為7.4的TM緩沖液，于勻漿器中勻漿，將勻漿液于4℃?，6000g離心20min后取含病毒的上清液，將離心所得的沉淀用1～2ml的TM緩沖液重懸，再次勻漿，將再次勻漿得到的勻漿液于4℃，6000g，離心20min，合并兩次離心所得的上清液，將合并所得上清液用0.45μm濾膜抽濾除去組織碎片，再用0.22μm的針式濾頭過濾除菌，除菌后的上清液每毫升加入1000IU青霉素和1000μg鏈霉素后，于4℃冰浴過夜處理，即得到甲魚系統性敗血癥球狀病毒接種液；

（3）選取健康，發育良好的4～6日齡的雞胚，將甲魚系統性敗血癥球狀病毒接種液按接種量0.15～0.2ml接種到雞胚的卵黃囊內，將已接種了病毒的雞胚于33.5℃的恒溫條件下培養9～10天，收集培養時間為第3～10天的死亡雞胚；?

（4）將步驟（3）得到的死亡雞胚分離出胚體、尿囊膜與卵黃囊液，混勻后加入10倍的pH為7.4的0.1?M的TM緩沖液，重復步驟（2）即得到含甲魚系統性敗血癥球狀病毒的上清液。

3.根據權利要求2所述的甲魚系統性敗血癥球狀病毒的雞胚培養方法，其特征在于：步驟（2）中采用的TM緩沖液配制方法是：Tris?6.0578g、MgCl.6H₂O?2.0338g補足雙蒸水至500ml，調節pH至7.4，高壓滅菌。