[發(fā)明專利]三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210019133.4
• 申請(qǐng)日: 2012-01-20
• 公開（公告）號(hào): CN102628030A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李登峰;彭嬌;劉聯(lián)國(guó);周永強(qiáng);陳炯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及三疣梭子蟹呼腸孤病毒的體外培養(yǎng)方法，尤其是涉及三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養(yǎng)方法。?

背景技術(shù)

呼腸孤病毒是一類宿主范圍很廣的病毒，其宿主可涵蓋哺乳動(dòng)物、禽類、昆蟲、水生動(dòng)物等。感染水生生物的一類呼腸孤病毒被歸類為水生呼腸孤病毒屬。Meyers等于1979年首次從美國(guó)牡蠣中分離到了水生呼腸孤病毒。目前分離鑒定的水生呼腸孤病毒有40余株。這些病毒主要通過(guò)呼吸和腸道侵染宿主，導(dǎo)致宿主出血病和肝臟與胰臟的疾病。在全球范圍內(nèi)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中造成了巨大的損失，嚴(yán)重威脅了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。水生呼腸孤病毒是水生動(dòng)物中普遍存在的病毒，在魚、蝦、蟹中均有報(bào)道。?

三疣梭子蟹是我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，在我國(guó)的江浙、兩廣、福建等地已經(jīng)開始成功的規(guī)模化養(yǎng)殖，近年來(lái)隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，各種病害頻繁爆發(fā)。課題組在對(duì)三疣梭子蟹病害的研究過(guò)程中，首次從患病的三疣梭子蟹體內(nèi)檢測(cè)到了呼腸孤病毒的存在，通過(guò)人工感染實(shí)驗(yàn)等研究確定其為秋冬季梭子蟹大量死亡的主要病原，該病毒給三疣梭子蟹的養(yǎng)殖帶來(lái)了巨大的損失。為了尋找預(yù)防和控制三疣梭子蟹呼腸孤病毒感染的有效方法，對(duì)該病毒開展病原生物學(xué)、診斷學(xué)、感染機(jī)理等方面研究顯得尤為重要。這就必須要有穩(wěn)定的病毒來(lái)源，最好的方法就是對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)。迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)病毒的體外培養(yǎng)多集中在細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)上，呼腸孤病毒雖然具有較廣的宿主范圍，但種間差異較大，因此，利用細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)三疣梭子蟹呼腸孤病毒進(jìn)行體外培養(yǎng)需要相應(yīng)的細(xì)胞株或細(xì)胞系，目前還沒有成熟的蟹細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。另外，細(xì)胞培養(yǎng)法存在培養(yǎng)成本高、培養(yǎng)條件要求高等缺點(diǎn)，同時(shí)還存在著病毒能否傳代的問(wèn)題。?

雞胚培養(yǎng)是一種廣泛運(yùn)用于哺乳動(dòng)物病毒、禽類病毒等的培養(yǎng)方法，如授權(quán)公告號(hào)為CN101633911A，公告日為2010年1月27日，發(fā)明名稱為“適合于大規(guī)模生產(chǎn)人用禽流感疫苗的純化技術(shù)中病毒的培養(yǎng)方法”，就采用了9-11日齡無(wú)畸形、血管清晰、活動(dòng)的健康雞胚進(jìn)行病毒培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方法可為規(guī)模化生產(chǎn)人用禽流感病毒裂解疫苗提供足夠的、合格的禽流感病毒。但是，病毒雞胚培養(yǎng)多見于一些高等動(dòng)物病毒的培養(yǎng)，在水生動(dòng)物病毒領(lǐng)域的研究應(yīng)用極其罕見。目前，國(guó)內(nèi)外還沒有關(guān)于利用雞胚培養(yǎng)方法培養(yǎng)蟹類病毒包括三疣梭子蟹呼腸孤病毒的方法的相關(guān)研究報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養(yǎng)方法，該方法首次將雞胚培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于三疣梭子蟹呼腸孤病毒的培養(yǎng)，可實(shí)現(xiàn)三疣梭子蟹呼腸孤病毒快速、高效、穩(wěn)定、便捷的體外傳代培養(yǎng)。?

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：?

一種呼腸孤病毒，所述病毒為三疣梭子蟹呼腸孤病毒(Portunnus?trituberculatusreovirus)，該病毒為球狀對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無(wú)囊膜，直徑30±10nm。毒株為R1015株，保藏號(hào)為CGMCC?No.5379，于2011年10月21日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。?

一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養(yǎng)方法，采用SPF雞胚作為三疣梭子蟹呼腸孤病毒的體外培養(yǎng)體系，選擇3-4日齡健康雞胚，將預(yù)先制備好的三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液接種至雞胚尿囊膜上，繼續(xù)培養(yǎng)直至雞胚出現(xiàn)死亡，收集培養(yǎng)時(shí)間為3-10天的死亡雞胚進(jìn)行勻漿、離心分離，得到含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液。?

具體的操作步驟如下：?

（1）選取符合SPF規(guī)格的新鮮種蛋，氣室向上38℃孵化，相對(duì)濕度50%，每4小時(shí)翻蛋一次，培養(yǎng)3-4天后，選取血管粗大且呈鮮紅色的健康發(fā)育良好的雞胚在暗室內(nèi)畫出氣室邊緣并標(biāo)明大血管所處位置，以備病毒接種用；

（2）選取感染呼腸孤病毒的三疣梭子蟹若干只，取鰓、肌肉和內(nèi)臟，按質(zhì)量體積比1g：10ml比例將鰓、肌肉和內(nèi)臟的混合物加入到PH為7.4的TNE緩沖液，于勻漿器中勻漿；將勻漿液于4℃，6000g，離心20min后取含病毒的上清液，將離心所得的沉淀用1～2ml的TNE緩沖液重懸，再次勻漿，將再次勻漿得到的勻漿液于4℃，6000g，離心20min，合并兩次離心所得的上清液，將合并所得上清液先用0.45μm的濾膜抽濾除去組織碎片，再用0.22μm的濾膜抽濾除菌，除菌后的上清液每毫升加入1000單位青霉素和1000ug鏈霉素后，于4℃冰浴過(guò)夜處理，即得到三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液；