[發明專利]一種短短芽孢桿菌菌株制備羥苯乙酯的方法

無效

• 申請號: 201210019087.8
• 申請日: 2012-01-20
• 公開（公告）號: CN102559786A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 劉波;車建美;朱育菁;史懷;陳崢;唐建陽
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院農業生物資源研究所
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12R1/08
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 宋連梅

【技術領域】

本發明涉及一種微生物制備化合物的方法，尤其涉及一種短短芽孢桿菌菌株制備羥苯乙酯的方法。?

【背景技術】

微生物是產生天然活性化合物的天然寶庫。據估計，現在已知的細菌不到總數的1％，已知的真菌不到總數的5％，表明還有成千上萬的微生物種類有待進一步開發(Leslie?AA)。由于不同的生態環境下微生物的種類和數量各不相同，因而就會產生不同種類和不同功能的次級代謝物。拮抗微生物在代謝活動中通過分泌抗菌物質直接對病原物產生抑制是自然界普遍存在的現象，也是眾多拮抗微生物應用的物質基礎。?

楊利珍等從瑞香狼毒根際這一獨特的生態環境中分離出一株高抑菌活性的青霉菌，乙酸乙酯相TLC法系統預試結果表明，其主要成分為揮發油、黃酮、萜類、甾體及其苷類、酚性成分、內酯及香豆素和有機酸類。魏鴻剛等發現青枯病生防菌菌株HY96發酵液的粗提物可能是分子量低于5kD的混合物，該混合物對青枯雷爾氏菌具有很好的拮抗作用。?

短短芽孢桿菌是一類革蘭氏染色陽性或可變、菌體桿狀、以周生鞭毛運動、產芽孢的一類細菌。據報道，短短芽孢桿菌產生的短桿菌素一般由九種核糖體產生的線狀短桿菌肽和二十八種以上非核糖體產生的短桿菌酪肽和tryptocidines組成，這些蛋白往往具有不同的生物活性(Rautenbach等)。?

羥苯乙酯(CAS120-47-8)為白色結晶性粉末，無臭或有輕微的特殊香氣，味微苦、灼麻。對真菌的抑菌效果較強，但對細菌的抑菌效果較弱。用作抑菌防腐劑，廣泛用于液體制劑、半固體制劑以及食品和化妝品的防腐。羥苯乙酯通常由鄰羥基苯甲酸(即水楊酸)與乙醇酯化而得，即利用化工合成制備羥苯乙酯，且目前未見關于從短短芽孢桿菌中制備羥苯乙酯方法的報道。?

【發明內容】

本發明所要解決的技術問題在于提供一種短短芽孢桿菌菌株制備羥苯乙酯的方法，即提供了一種獲得羥苯乙酯的新途徑，避免了化工合成對環境所造成的污染。?

本發明是通過以下技術方案解決上述技術問題的：一種短短芽孢桿菌菌株制備羥苯乙酯的方法，其具體包括如下步驟：?

(1)短短芽孢桿菌菌株FJAT-0809-GLX的活化：用接種環將短短芽孢桿菌FJAT-0809-GLX劃線于菌株培養基上，并于恒溫培養箱中培養24h，且培養溫度設定為30℃；?

(2)制備種子液：將步驟(1)所獲得的短短芽孢桿菌菌株FJAT-0809-GLX的單菌落接種于100mL的種子培養基中，并將其置于恒溫振蕩搖床中培養24h，溫度30℃，轉速180rpm；?

(3)制備液體發酵液：按10％移種量將步驟(2)所獲得的種子液轉入已消毒滅菌的發酵培養基中培養，溫度30℃，轉速180rpm，并在培養過程中每隔一段時間取適量的發酵液檢測其pH值及孢子數量，當其孢子數達到10×10⁸/mL時則獲得所需的液體發酵液；?

(4)短短芽孢桿菌菌株FJAT-0809-GLX次生代謝產物的制備及活性檢測：將步驟(3)所獲得的短短芽孢桿菌菌株FJAT-0809-GLX發酵液置于常溫下離心30min，且離心轉速為3600rpm，離心結束后取上清液，該上清液經大孔樹脂富集，并將富集所得的富集液進行濃縮，濃縮所得物質為短短芽孢桿菌菌株FJAT-0809-GLX的次生代謝產物，并采用抑菌圈法檢測所得次生代謝產物的活性；?

(5)羥苯乙酯的分離純化：將步驟(4)中所獲得的具有活性的次生代謝產物經丙酮萃取，且所得萃取物經硅膠柱進一步進行分離純化，該分離純化后得到的產物即為所述的羥苯乙酯。?

進一步地，所述步驟(4)中的大孔樹脂采用大孔樹脂AmberliteXAD16。?

進一步地，所述步驟(4)中的大孔樹脂富集的具體操作如下：先將所述上清液與大孔樹脂混合，且按每升所述上清液中加40g大孔樹脂的量進行混合，并將該混合所形成的混合液置于30℃下振蕩4h，振蕩轉速為160rpm；?接著將振蕩結束后的混合液填入層析柱；之后采用蒸餾水將層析柱的混合液洗至無色；然后再用3倍洗脫體積的丙酮進行洗脫，并收集富集液即丙酮洗脫液；最后將該富集液于40℃下旋轉蒸發進行濃縮，濃縮所得物質即為短短芽孢桿菌菌株FJAT-0809-GLX的次生代謝產物。?