[發明專利]一種組織工程軟骨及其制備方法

有效

• 申請號: 201210019026.1
• 申請日: 2012-01-20
• 公開（公告）號: CN102526806A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 田智泉
• 申請（專利權）人: 陜西博鴻生物科技有限公司
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/36;A61L27/24;A61L27/20;A61F2/28
• 代理公司: 中國科學院西安專利中心 61001
• 代理人: 任越

1.一種組織工程軟骨，其特征在于，所述的軟骨為具有細胞活性的類天然軟骨組織結構，由表層、中層、深層和鈣化層依次層狀排列的細胞膜片構成，主要成分為膠原基質；其中，表層由滑膜間充質細胞及其分泌的細胞外基質構成，在軟骨組織微環境下所形成致密的纖維化軟骨表層；中層由軟骨細胞及其分泌的具有透明軟骨特征的細胞外基質構成；深層由骨髓間充質干細胞誘導分化的軟骨細胞及其分泌的細胞外基質構建，具有向肥大軟骨細胞轉化的特性；鈣化層由骨髓間充質干細胞誘導分化的成骨細胞及其分泌的細胞外基質構建；各層之間以膠原及透明質酸復合，在體外流體靜壓條件下培養后，能夠促進各層軟骨結構邊界融合。

2.制備權利要求1所述組織工程軟骨的方法，其特征在于，是采用軟骨細胞、滑膜間充質干細胞和骨髓間充質干細胞經誘導培養，分別制備成細胞膜片，以膠原及透明質酸復合，經體外流體靜壓條件下培養，得到具有天然層狀結構和生理功能的組織工程軟骨。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，具體步驟包括：

步驟一、制備軟骨鈣化層：取第3～4代骨髓間充質干細胞按0.5×10⁵/cm²～5×10⁵/cm²的密度接種在細胞培養孔板內，待細胞貼壁后更換培養液A培養7～21天，使骨髓間充質干細胞誘導分化為成骨細胞并形成膜狀結構，完成軟骨鈣化層制備；所述培養液A的組成為：在商用高糖型DMEM培養液中含有，胎牛血清100ml/L、地塞米松10^-9～10^-8mol/L、β-甘油磷酸鈉2～20mmo?l/L和抗壞血酸10～100μg/mL；

步驟二、制備軟骨深層：將第3～4代骨髓間充質干細胞以0.2×10⁵/cm²～5×10⁵/cm²的密度接種在細胞培養孔板內，待細胞貼壁后更換培養液B誘導培養7～15天，使骨髓間充質干細胞誘導分化為軟骨細胞并形成膜狀結構，完成軟骨深層制備；所述培養液B的組成為：在商用高糖型DMEM培養液中含有，轉化生長因子β₁為1～20ng/mL、堿性形成纖維生長因子-2為2～15ng/mL、地塞米松10^-8～10^-6mol/L、胰島素5～15μg/mL、亞硒酸鈉5～15μg/L、牛血清白蛋白1～5g/L、Vc為15～100μg/mL和丙酮酸鈉75～200μg/mL；

步驟三、制備軟骨中層：將1～4代的軟骨細胞按0.5×10⁵/cm²～5×10⁵/cm²的密度接種在細胞培養孔板內，加入培養液C培養7～15天，每2～3天換液一次，完成軟骨中層制備；所述培養液C的組成為：在商用低糖型DMEM培養液中含有，胎牛血清100ml/L、L-谷氨酰胺10～500μg/mL、Vc為50～100μg/mL、TGF-β₁為5～10ng/mL、bFGF-2為5～50ng/mL；

步驟四、制備軟骨表層：將滑膜間充質干細胞以0.5×10⁵/cm²～8×10⁵/cm²的密度接種在步驟三制備的軟骨中層表面，采用培養液D培養3～7天，完成軟骨表層的制備及其與軟骨中層的組裝；所述培養液D的組成為：在商用低糖型DMEM培養液中含有，胎牛血清100ml/L、L-谷氨酰胺50～500μg/mL、Vc為25～100μg/mL、TGF-β₁為1～10ng/mL、bFGF-2為3～15ng/mL、地塞米松為10^-8～10^-6mol/L；

步驟五、組織工程軟骨多層結構的組裝：將上述制備的各層軟骨組織，按層狀排列由上到下分別為：表層、中層、深層與鈣化層，各層之間采用以2～8mg/mL濃度的膠原與10～40mg/mL濃度的透明質酸按2∶1體積比混合的混合液粘合，形成層狀結構；將該層狀結構置入無菌密封的包裝袋內，加入培養液E，排凈袋內空氣后密封，再放入壓力裝置的壓力艙內，艙內灌滿無菌水排凈氣泡進行培養，設置流體靜壓力參數為0.1～2Hz、50～15000kPa；37℃恒溫條件下，每天加壓2～8小時，培養4～15天，完成組織工程軟骨的制備；所述培養液E的組成為：在商用低糖型DMEM培養液中含有，胎牛血清100ml/L、L-谷氨酰胺50～300μg/mL、Vc為50～200μg/mL、TGF-β₁為3～15ng/mL、bFGF-2為5～20ng/mL和地塞米松1×10^-8～5×10^-6mol/L。