[發明專利]一種豬細環病毒Ⅱ型抗體間接阻斷ELISA檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201210018567.2
• 申請日: 2012-01-20
• 公開（公告）號: CN102590503A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 徐志文;朱玲;李凇;劉驍;郭萬柱;廖珊
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N33/531
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技術領域

本發明涉及豬的一種病毒抗體檢測方法，具體說是豬細環病毒II型(TTV2)抗體的間接ELISA檢測方法。?

背景技術

養豬業是我國畜牧養殖業的重要組成部分，在我國的農業經濟中占有著非常重要的地位，然而豬病的肆虐不但制約著我國養殖業向規?；?、集約化方向的邁進，而且影響著我國畜牧類產品的進出口等國際化多邊貿易的發展，同時會給國家和地區帶來巨大的社會、經濟和人類生命財產損失。豬細環病毒常與豬圓環病毒、藍耳病毒發生混合感染，給豬的生產帶來了嚴重的影響和危害。豬細環病毒的防控直接影響著我國養豬業的發展，是我國畜牧業生產所關注的重點。?

1997年12月，日本學者Nishizawa等利用代表性差異分析法(represenatational?difference?analysis)，首次從一位名為Torque?Tero的輸血后非甲-非庚型肝炎病人的血清中克隆獲得了一種新的不明病原DNA(N22)，克隆的病毒DNA序列并不與任何一條參考序列相同或相近，因此證明此病毒可能是一個新的病毒。近十五年來，學術界對TTV的研究取得了一定的進展，對該病毒有了較深的認識。2005年國際病毒分類命名委員會將該病毒分類為圓環病毒科指環病毒屬，并統一命名為Torque?Tero病毒，而不稱其為輸血傳播病毒(transfusion?trarismitted?virus?TTV)，我國學者也將其翻譯為細環病毒。該病毒為一種小的十二面體的無囊膜的單股環狀負鏈DNA病毒，能感染多種脊椎動物，包括人和豬。根據基因序列差異，將豬的TTV分為兩種不同的基因型，即基因I型和基因II型(TTV1和和TTV2)。?

2002年，日本學者Okamoto首次從豬體內檢測到了種屬特異的豬TTV病毒的存在，與人TTV屬于同一類，此后世界各地陸續報道該病毒的發現。目前已經證明TTVs與PRRSV、PCV等混合感染會加重豬皮炎和腎病綜合癥(PDNS)和斷奶和多系統衰竭綜合征(PMWS)的癥狀。?

TTV在豬群中的感染呈全球性分布，包括美國、加拿大、中國、臺灣、韓國、法國、?意大利和西班牙等國都有不同程度的感染，其感染率在24％～100％。通常在同一豬群中TTV2的感染率較TTV1高，母豬較公豬易感。同一國家不同地區或不同豬場中TTV感染存在很大的差異。對意大利不同豬場的調查發現，一些豬場不存在TTV1的感染，然而另外一些豬場的感染率卻高達53％。對我國廣東、福建、江西、河北、安徽、浙江和河南7省258份豬血樣品的TTV檢測結果表明：TTV感染率在24.1％～100％之間。此病毒感染一旦發生，就很難控制和消滅，因此及時準確的檢測TTV，預防和控制該病毒的感染，對于畜牧業特別是養豬業具有重大的意義。?

目前豬TTV的檢測主要依賴PCR技術，但也有人應用雙抗原夾心酶聯免疫法(ELISA)。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種豬細環病毒抗體間接阻斷ELISA檢測試劑盒及豬細環病毒II型ORF1基因優勢抗原表位區所表達蛋白(在本發明申請中以下簡稱ORF1蛋白)作為抗原(在本發明申請中以下簡稱為重組抗原)包被酶標反應板的制備方法，為臨床檢測豬細環病毒抗體提供快速、準確、簡便的檢測工具。?

本發明技術方案：?

一種豬細環病毒抗體間接阻斷ELISA檢測試劑盒，包括抗體檢測板，酶結合物工作液，樣品稀釋液，顯色液A，顯色液B，終止液；阻斷抗體，洗滌緩沖液；所述的阻斷抗體為使用純化后的TTV2-ORF1基因抗原表位區蛋白免疫家兔后，從家兔體內獲得的多克隆抗體；?

所述酶結合物工作液為：商品化的辣根過氧化物標記的山羊抗兔抗體，進行1∶12000稀釋的稀釋液，酶標二抗直接加入酶標二抗稀釋液中，酶標二抗稀釋液為：KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O?2.9g，NaCl?29g，KCl?0.2g，PEG6000?40g，加ddH₂O定容至1000ml，加入0.01％～0.05％硫柳汞，調pH至7.4；?

所述樣品稀釋液為：KH₂PO₄?0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O?2.9g，NaCl?29g，KCl?0.2g，PEG600040g，加ddH₂O定容至1000ml，加入0.01％～0.05％疊氮鈉，調pH至7.4；?