[發(fā)明專利]一種羊口瘡病毒蛋白ORFV059單克隆抗體雜交瘤A3及單克隆抗體

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210017376.4
• 申請日: 2012-01-19
• 公開（公告）號: CN102559605A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設計）人: 羅樹紅;郝文波;李宏;廖小青;李明
• 申請（專利權）人: 南方醫(yī)科大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/08;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

?

技術領域

本發(fā)明涉及細胞工程領域，具體涉及羊口瘡病毒結構蛋白ORFV059單克隆抗體雜交瘤細胞株A3及單克隆抗體。

背景技術

羊傳染性膿皰病（Orf）又稱羊傳染性膿皰性炎，俗稱羊口瘡，是由羊口瘡病毒（ORFV）引起的山羊和綿羊的一種急性、接觸性傳染病。其病變特征是患羊口唇等處皮膚和黏膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和疣狀結痂。羔羊極易感，多群發(fā)。本病在世界各地均有發(fā)生，我國主要養(yǎng)羊區(qū)也較常見，是危害羊群的主要疾病之一。該病毒抵抗力強，羊群一旦被感染則不易清除，可持續(xù)危害羊群多年，給畜牧業(yè)造成重大經濟損失。

ORFV病毒屬痘病毒科，副痘病毒屬。病毒粒子呈磚形或橢圓形，其表面呈繩索樣縱橫交錯排列結構。該病毒可在牛、綿羊、山羊的腎細胞以及犢牛和羔羊的睪丸細胞上生長，并產生細胞病變。ORFV引發(fā)病灶的病理組織學特征包括角化細胞的空泡變化、腫脹，細胞間質玻璃樣變性，表皮增生顯著,??表皮內微腫脹，皮下組織中性粒細胞、樹突狀細胞(DCs)、T細胞和B細胞聚集。

羊口瘡分布廣泛，傳染性強，一旦爆發(fā)會造成嚴重的經濟損失。病毒在病變部位持續(xù)存在，患病動物易重復感染，目前無有效疫苗，防控困難。因此，羊口瘡病毒的早期、準確檢出對于疾病的控制和預防具有重要的意義。獸醫(yī)臨床上羊口瘡病的診斷主要根據其典型癥狀進行診斷，但無法與口蹄疫（foot-and-mouth?disease,FMD）和羊痘（Capripox）區(qū)分。目前所采用的實驗室診斷方法分為，(1)?免疫學方法，如ELISA,?Western?blotting等;?(2)?病理組織學方法，如免疫組織化學（IHC）等;?(3)分子生物學方法，如PCR和限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析等。其中以免疫學診斷方法最為重要，因其具有靈敏、快速、準確的特點，而特異性的抗體尤其是單克隆抗體是免疫學診斷中最重要的工具。近年，在我國吉林省和甘肅省的羊群中幾次爆發(fā)羊口瘡疫情，由于特異性抗體的缺乏，疾病控制和進一步研究工作無法有效開展。

ORFV基因組全長約138kb，G+C含量豐富（63%-64%），含132個基因。通過對羊口瘡病毒不同株(系)的基因組分析表明，ORFV059基因編碼的是一個免疫顯性蛋白。該蛋白定位于成熟病毒粒子胞膜，?是C端錨定蛋白,?與痘苗病毒H3L免疫顯性蛋白結構相似，它在病毒成熟、吸附、致病的分子機制以及疾病診斷和亞單位疫苗研發(fā)等過程中具有重要作用。因此，ORFV059有作為潛在的臨床診斷靶標的可能，制備ORFV059的單克隆抗體具有十分重要的意義，可以為該蛋白功能的研究奠定基礎，同時為其作為疾病標志物的可行性提供實驗數(shù)據支持。

由于ORFV059定位于成熟病毒粒子胞膜，通常在組織標本中表達量較高，具有臨床檢測和驗證的價值。由此，制備能用于臨床標本免疫組化檢測的ORFV059單克隆抗體進行大批量組織標本的驗證，可為其作為羊口瘡臨床診斷靶標的驗證提供有力工具。

本發(fā)明具有以下的特點和優(yōu)勢：

目前國內外尚未有商品化ORFV059的抗體，且其單抗亞型為IgG2b型，能用于ELISA、western-blot、免疫熒光以及免疫組織化學檢測，從而為該蛋白作為臨床靶標驗證及其功能的研究奠定了堅實的基礎。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種能用于ELISA、western-blot、免疫熒光以及免疫組織化學檢測的抗羊口瘡病毒蛋白ORFV059單克隆抗體。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

本發(fā)明所述的檢測羊口瘡病毒蛋白ORFV059的抗體是用原核重組表達的ORFV059蛋白作為抗原免疫BALB/C小鼠獲得，并用細胞融合技術獲得產生這種抗體的雜交瘤細胞株A3，雜交瘤細胞分泌的抗體為IgG2b陽性，輕鏈為κ型。所述抗羊口瘡病毒蛋白ORFV059單克隆抗體雜交瘤A3，于2011年11月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.5424。

本發(fā)明中羊口瘡病毒蛋白ORFV059的氨基酸序列為AAR98154，如SEQ?ID?NO：1所示。本發(fā)明中羊口瘡病毒蛋白ORFV059的基因序列為AY386263，如SEQ?ID?NO：2所示。