[發明專利]一種番茄基因組總DNA提取試劑盒及其提取方法

無效

• 申請號: 201210016509.6
• 申請日: 2012-01-19
• 公開（公告）號: CN102533731A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 梁燕;孫亞東;吳江敏;鄭戌翔
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.番茄基因組總DNA提取試劑盒，其特征在于，包括以下試劑：

(1)1M?Tris-HCl(pH8.0)：稱取Tris·base?12.114g，用少量蒸餾水加熱溶解，溶解后用濃鹽酸調節pH＝8.0，最后加水定容至100mL，121℃?25min高壓滅菌；

(2)0.25M?EDTA(pH8.0)：稱取EDTA鈉鹽9.305g，加少量蒸餾水溶解后，用NaOH調至pH＝8.0，最后加水定容至100mL，121℃?25min高壓滅菌；

(3)2.5M?NaCl：稱取14.625g?Nacl，加蒸餾水溶解后定容至100mL；

(4)TE(pH8.0)溶液：量取前面滅過菌的1M?Tris-HCl(pH8.0)1mL，0.25MEDTA(pH8.0)0.4mL，加水定容至100mL備用；

(5)Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)：量取50mL?Tris飽和酚，48ml氯仿和2mL異戊醇，混勻即可；

(6)氯仿∶異戊醇(24∶1)：量取96ml氯仿和4mL異戊醇，混勻即可；

(7)70％乙醇：量取70mL無水乙醇，加水定容至100mL；

(8)3M乙酸鈉(PH＝5.2)：稱量40.8gNaAC·3H2O于100ml燒杯中，加入約40ml的蒸餾水攪拌溶解，加入冰醋酸調節PH值至5.2，蒸餾水定容至100ml，121℃?25min高壓滅菌；

(9)無水乙醇；

(10)2×CTAB提取液；

(11)β-巰基乙醇；

(12)異丙醇。

2.應用權利要求1所述試劑盒進行番茄基因組總DNA提取的方法，其特征在于，按照以下步驟進行：(1)樣品的采集與研磨：采摘番茄植株上10片長寬約1cm的幼嫩葉片，裝入2ml的離心管，加滿液氮后置于預冷的離心管架上迅速用研磨棒研磨至粉末狀；(2)粗提DNA：加65℃的2×CTAB提取液900ul和30ul的β-巰基乙醇，混合均勻后65℃水浴60min，每隔5min上下顛倒混勻一次；(3)抽提DNA：取出離心管放冰上冷卻10min，加4℃預冷的Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次，加4℃預冷的氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液抽提2次，轉移上清至1.5ml的離心管；(4)沉淀與洗滌DNA：加4℃預冷的異丙醇溶液和醋酸鈉溶液，放-20℃下沉淀3h，4℃?14000rpm離心10min，棄上清，加70％的乙醇溶液洗滌沉淀2次，加無水乙醇溶液洗滌沉淀1次，通風櫥內風干后加TE溶液溶解沉淀；(5)純化DNA：向管內加RNAase，37℃水浴60min，加4℃預冷的Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液抽提1次，加氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液抽提2次，轉移上清至新1.5ml離心管；(6)沉淀、洗滌、溶解DNA樣品：加4℃預冷的異丙醇溶液和醋酸鈉溶液，放-20℃冰箱中沉淀3h，4℃?14000rpm離心10min，棄上清，加70％的乙醇溶液洗滌沉淀2次，加無水乙醇溶液洗滌沉淀1次，通風櫥內風干，加TE溶液溶解沉淀，放-20℃下長期保存。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(1)中所采摘的番茄幼嫩葉片為番茄生長側枝上的葉片，葉片應依次放入離心管，相互之間不能擠壓。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(2)中的2×CTAB提取液，每100ml?2×CTAB提取液由10％的CTAB(W/V)溶液20ml、1M?Tris-HCl(pH＝8.0)溶液10ml、0.25M?EDTA(pH＝8.0)溶液8ml、0.25M?NaCl溶液56ml，雙蒸水6ml組成。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(3)中所加Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液為900ul進行1次抽提，所加氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液的體積與第一次抽提后所取上清體積相同，每次所取上清體積和所加溶液體積為800ul～850ul。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(4)中所加異丙醇溶液為700ul，3M乙酸鈉溶液為70ul，所加70％乙醇溶液、無水乙醇溶液和TE溶液均為200ul，每100mlTE溶液由1M?Tris-HCl(pH＝8.0)1mL，0.25M?EDTA(pH＝8.0)0.4mL，雙蒸水98.6mL配制而成。