[發(fā)明專利]一種高危人乳頭瘤病毒的PCR檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210016078.3
• 申請(qǐng)日: 2012-01-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102559932A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林希瑾;秦偉;胡守旺;謝佐福;周曉強(qiáng);姚銘鋒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 泰普生物科學(xué)（中國(guó)）有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 福州市鼓樓區(qū)博深專利代理事務(wù)所(普通合伙) 35214
• 代理人: 林志崢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種疾病病原體基因檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種高危人乳頭瘤病毒的PCR檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

人乳頭瘤病毒(human?papillomavirus，HPV)的存在與多種皮膚黏膜的良、惡性增生，特別是宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，病毒的各型基因序列與其生物學(xué)行為存在著高度相關(guān)性。不同基因型的HPV具有不同的致病危險(xiǎn)性。HPV?DNA的檢測(cè)和分型對(duì)了解相關(guān)病情、判斷預(yù)后及指導(dǎo)治療具有重要價(jià)值，特別是對(duì)女性生殖道腫瘤的癌情預(yù)報(bào)具有重要意義。由于缺乏體外培養(yǎng)系統(tǒng)和可靠的血清反應(yīng)物，所以HPV的分類幾乎完全依賴于其分子學(xué)特性。根據(jù)定義，如果L1開(kāi)放閱讀框中特定的291bp有10％不同就屬于不同的HPV型。目前世界上發(fā)現(xiàn)的HPV有110余種亞型，20余種HPV亞型從宮頸癌組織中分離，根據(jù)其致病力的大小分為高危型和低危型兩種，國(guó)際癌癥研究協(xié)會(huì)對(duì)9個(gè)國(guó)家11次病例對(duì)照研究資料分析，將HPV6，11，40，42，43，44，54，61，70，72，81，cp6108等12種歸為低危型，主要引起生殖道肛周皮膚和陰道下部的外生性濕疣類病變、扁平濕疣類病變和低度子宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CINI)，多呈一過(guò)性，可自然逆轉(zhuǎn)；高危型主要為HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82等15種，主要導(dǎo)致CINII-III級(jí)病變和宮頸癌的發(fā)生，持續(xù)高危型HPV感染的CINI級(jí)易進(jìn)展為CINII～I(xiàn)II。

在全球范圍內(nèi)，每年約有20多萬(wàn)女性死于宮頸癌。在發(fā)展中國(guó)家，宮頸位置宮頸癌則屬于常見(jiàn)多發(fā)的婦科腫瘤，排行榜首。我國(guó)每年新發(fā)現(xiàn)的病例為13.15萬(wàn)，死亡率最高的地區(qū)是山西，最低的是西藏。當(dāng)宮頸癌的癥狀出現(xiàn)三個(gè)月后就診者已有2/3為癌癥晚期。經(jīng)臨床追蹤觀察顯示，從一般的宮頸癌前病變發(fā)展為宮頸癌大約需要10年時(shí)間。從這個(gè)角度看，宮頸癌并不可怕，它是一種可預(yù)防、可治愈的疾病。防治的關(guān)鍵在于：定期進(jìn)行婦科檢查，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療宮頸癌前病變，終止其向?qū)m頸癌的發(fā)展。如能落實(shí)防治措施，宮頸癌的治愈率很高。宮頸癌也是目前唯一確切知道病因的癌癥，這一病因就是HPV感染。因此，檢測(cè)病毒，特別是高危型病毒可預(yù)示宮頸癌的發(fā)生。

目前HPV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有兩大類，第一類是檢查HPV的感染間接證據(jù)，如醋酸白試驗(yàn)，細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)檢查等。由于這些方法檢測(cè)的是HPV感染后對(duì)機(jī)體造成的異常變化，而HPV感染后對(duì)機(jī)體造成特定的異常變化需要一定的時(shí)間，因此這些方法只能檢測(cè)出亞臨床期和臨床期，檢測(cè)不出潛伏期，對(duì)臨床的早期診斷意義不大。

第二類是檢查組織中是否有HPV存在，如免疫組化，超薄切片電鏡技術(shù)或負(fù)染技術(shù)，以PCR為基礎(chǔ)和HPV核酸分子檢測(cè)等。由于這些方法檢測(cè)的是HPV感染的直接證據(jù)，在時(shí)間上可比第一類方法能更早地檢測(cè)出HPV感染，更適合早期診斷。免疫組化檢測(cè)標(biāo)本中是否存在HPV抗原，敏感性低，特異性高，繁瑣、費(fèi)時(shí)，目前已逐漸被淘汰。核酸印跡雜交的靈敏度及特異性均較高，但費(fèi)時(shí)，繁雜，花費(fèi)大，需用新鮮標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)室條件要求高，目前還未普遍用于臨床。超薄切片電鏡技術(shù)及負(fù)染技術(shù)可在電鏡下看到典型的乳頭瘤病毒顆粒，但受實(shí)驗(yàn)條件限制，一般的實(shí)驗(yàn)室很少采用。以PCR為基礎(chǔ)和HPV核酸分子檢測(cè)成為目前HPV檢測(cè)的主流方法。

(1)測(cè)序分析法(Sequence-based?test，SBT)：該方法優(yōu)點(diǎn)是獲取序列信息最多，可以明確被測(cè)區(qū)域的多態(tài)性，并能發(fā)現(xiàn)新基因，是其他所有方法的參考標(biāo)準(zhǔn)。但測(cè)序法對(duì)混合感染也不易確定，特別是對(duì)于混合感染病毒比例在25％以下時(shí)，容易造成漏檢，而且測(cè)序法操作繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，儀器費(fèi)用高昂，難以在臨床上推廣使用。

(2)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction?fragment?length?polymorphism，PCR-RFLP)：是較早出現(xiàn)的HPV基因分型檢測(cè)方法，利用PCR擴(kuò)增具有不同酶切位點(diǎn)的各種HPV基因型，將PCR產(chǎn)物用3-5種不同限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，電泳結(jié)果與已知限制性片段數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，從而確定基因型。但該方法操作流程相對(duì)比較復(fù)雜，檢測(cè)型別有限。